| Autore |
Discussione |
|
|
carmilla983
Nuovo Arrivato
Prov.: al
Città: alessandria
59 Messaggi |
 Inserito il - 20 febbraio 2008 : 13:31:55
|
in un esperimento sono state usate sonde fluorescenti (di cui non so il nome) chelanti per il calcio allo scopo di vedere il ruolo dell'atp su cellule endoteliali. come funzionano queste sonde?hanno attaccato alla propria struttura un fluorocromo?
ed invece le sonde raziometriche che struttura hanno?
potreste farmi qualche esempio?
grazie
|
|
|
|
|
la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2008 : 15:05:39
|
non sapendo il tipo di sonda non so dirti il meccanismo con cui si rileva il ruolo dell'ATP, avrei un articolo dove si parla di raziometrici e non raziometrici ed avrei anche un ppt che però pesa un po' e adesso sono di fretta se vuoi però te lo faccio avere nei prossimi giorni, comunque se come penso valuti il ruolo dell'ATP misurando il segnale del calcio si usano molecole che formano complessi selettivi e reversibili con gli ioni calcio.
Queste molecole hanno diverse caratteristiche fisico-chimiche della forma libera e della forma legata allo ione che permettono la misurazione della concentrazione dello ione, es. differenze in assorbanza ed emissione. Lo spettro di eccitazione o emissione cambia a seconda che la molecola sia legata allo ione calcio oppure no. Viene quindi monitorata la quantita’ di probe libero e complessato e la concentrazione di calcio viene misurata sulla base della costante di dissociazione (Kd) della sonda in uno specifico ambiente
Il primo probe fluorescente per il calcio (BAPTA) è stato disegnato razionalmente a partire dal meglio conosciuto agente chelante specifico per il calcio, l' EGTA, ancora negli anni '70. Le modifiche conformazionali indotte dal legame dello ione ai gruppi carbossilici sono trasmesse al cromoforo e si manifestano come cambi nelle proprieta’ di eccitazione ed emissione del colorante.
Benche’ estremamente differenti in termini di proprieta’ spettrali
e di affinita’ di legame per il calcio, tutti i coloranti poli-carbossilati attualmente disponibili derivano dalla molecola originale.
tutte queste cose sono nel powerpoint se non riesco a trovare tempo di farti un discorso oprganico con figure ecc te lo mando x mail
|
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
 |
|
|
la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2008 : 15:07:26
|
poi vorrei chiedere ai moderatori perchè il sito non mi carica un pdf di 3,5 MB |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
|
|
|
carmilla983
Nuovo Arrivato
Prov.: al
Città: alessandria
59 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2008 : 16:16:20
|
volevo sapere come funzionano in genere le sonde fluorescenti e quelle raziometriche in modo sintetico...
deduco che allora non possono essere molecole con target su molecole cellulari coniugati ad un fluorocromo?
dagli appunti di un corso che ho seguito, io ho capito così..non importa il ruolo di ATP, n mi interessa.
grazie la fra! |
|
|
|
la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2008 : 16:49:33
|
certo che sono molecole con un fluorocromo sennò come si fa ad avere il segnale di fluorescenza? o meglio, un fluorocromo è semplicemente una molecola in grado di emettere fluorescenza.. che la sonda sia una molecola che riconosce un target con attaccato un pezzo in grado di dare fluorescenza, o una molecola che per le sue caratteristiche strutturali è in grado di dare fluorescenza non cambia nulla, Fura-2, Indo-1 Quin-2 e derivati e tutte queste altre sonde che legano il calcio di cui parlavo sono indicatori fluorescenti eccitati dalla luce UV. Le sonde raziometriche non è che abbiano una struttura particolare, sono queste stesse sonde fluorescenti il termine è riferito ad una loro proprietà, gli spettri di eccitazione (o emissione) dei coloranti raziometrici (i.e. FURA-2,INDO-1) cambiano a seconda della concentrazione di calcio libero. La concentrazione di calcio e’ misurata come rapporto fra i valori di intensita’ di fluorescenza che vengono registrati a due lunghezze d’onda.
I coloranti RAZIOMETRICI correggono variazioni indotte dal non uniforme caricamento del colorante, dal bleaching, dallo shift di piano focale e dal diverso percorso ottico, poiche’ il rapporto non dipende dal valore assoluto di intensita’ di fluorescenza. Nei coloranti NON RAZIOMETRICI (i.e.FLUO e RHOD)la concentrazione di calcio e’ determinata esclusivamente dall’aumento dell’intensita’ di fluorescenza . L'eccitazione con singola lunghezza d’onda permette l’utilizzo di apparecchiature meno sofisticate o l’osservazione simultanea di altri parametri cellulari. Questi coloranti lavorano solitamente nel range della luce visibile.
se vuoi il powerpoint te lo mando se non lo vuoi al momento non mi posso mettere a spezzetare il ppt con tutte le sue fig e caricartele sulla pg perchè sono in lab
vedi te se ti basta quello che ho scritto sennò prima o poi passerà di qui chick
  |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
|
|
|
carmilla983
Nuovo Arrivato
Prov.: al
Città: alessandria
59 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2008 : 17:28:06
|
| non ti disturbare, non ti ho chiesto di spezzettare la ppt..mi basta ciò che hai scritto. grazie. |
|
|
|
la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2008 : 21:49:39
|
| non era assolutamente mia intenzione essere scortese è che quando sono in lab se capita un momento in cui posso mettermi al pc è aver un momento di c..o, se pensi di averne bisogno te lo mando volentieri anche perchè se scrivo di fretta ho il dubbio di non riuscire ad essere particolarmente chiara, è che sul sito non si possono caricare documenti > 5MB perciò te lo dovrei mandare x mail, ri-ciao |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2008 : 22:01:01
|
Il pdf da 3.5 mb mi sa che va oltre il limite supportato dal forum sorry... puoi provare a comprimerlo (zip) e vedere se diventa più piccolo o mandarlo via email a carmilla 
Per il resto confermo quanto detto da la_fra, ma faccio una piccolissima correzione:
Citazione:
I coloranti RAZIOMETRICI correggono variazioni indotte dal non uniforme caricamento del colorante, dal bleaching, dallo shift di piano focale e dal diverso percorso ottico, poiche’ il rapporto non dipende dal valore assoluto di intensita’ di fluorescenza.
Vero anche se non sempre al 100%. Il bleaching può avere cinetiche diversa alle 2 lunghezze d'onda, quindi in quel caso hai una correzione solo parziale.
Ricordo inoltre che queste non sono le uniche sonde utilizzate per il calcium imaging. Esistono i cosiddetti GECI (genetically encodable calcium indicators) come Pericam, Camgaroo, Cameleon, G-CaMP che sono molecole proteiche derivate da una cpGFP (circularly permuted green fluorescent protein) che possono legare il calcio (solitamente tramite un dominio preso dalla calmodulina). Queste sonde possono essere sia raziometriche che non raziometriche.
Il vantaggio di queste sonde è che non devono essere caricate sulle cellule, si possono far esprimere sotto promotori specifici solo per un certo tipo cellulare e che si possono generare animali transgenici che le esprimono.
Lo svantaggio è che di solito le cinetiche di risposta di queste grosse molecole sono molto più lente di quelle dei piccoli indicatori sintetici e quindi non possono rilevare cambi molto molto rapidi nelle concentrazioni di Ca++ (anche se per molte applicazioni sono sufficientemente veloci).
Esistono anche sonde ibride (in realtà ne conosco una sola ma non escludo che ne abbiano fatte altre) come Calcium-Green FlAsH che è una sonda codificata geneticamente che ha bisogno di una piccola molecola sintetica per essere attivata. Questa ha il vantaggio di poter essere selettivamente espressa dove vuoi tu ma di essere comunque molto veloce (perchè il cromoforo sta sulla molecola sintetica).
E' stata usata qui per vedere il passaggio di ioni da un singolo canale:
Calcium Green FlAsH as a genetically targeted small-molecule calcium indicator.
|
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
carmilla983
Nuovo Arrivato
Prov.: al
Città: alessandria
59 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2008 : 19:53:57
|
la sonda per esempio fluo3 è una sonda eccitabile nel visibile e la sua fluorescenza aumenta con l'aumentare della concentrazione di calcio. è una sonda non raziometrica chelante il calcio..s dice così? è la stessa sonda che chela il calcio ed è questo complesso che emette fluorescenza a 520 nm giusto?
grasie |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2008 : 07:41:57
|
Esatto, il termine sonda per il calcio è equivalente a "molecola che ti permette di misurare il livello di calcio". Poi, può essere una proteina, una piccola molecola sintetica o quello che vuoi tu, il termine sonda vuol dire che ti permette di "sondare" (=misurare) qualcosa!
Fluo-3, così come Rhod-2 e Calcium Green funzionano come hai detto tu, aumentando fluorescenza quando legano il calcio.
Altre sonde tipo Quin-2, Fura-2 e Indo-1 invece hanno spostamento nel massimo di emissione o eccitazione al legame del calcio. |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
carmilla983
Nuovo Arrivato
Prov.: al
Città: alessandria
59 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2008 : 09:38:14
|
| capito...grazie! |
|
|
|
kiko6361
Nuovo Arrivato
Città: Verona
37 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2008 : 12:46:40
|
Ciao! Sempre tornando al discorso delle sonde fluorescenti chi mi può spiegare la differenza tra "fast dye" e "slow dye"?
Per me il fura 2 è una fast dye...o sbaglio?
Grazie |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2008 : 16:13:57
|
esatto. dipende dalla cinetica di legame al calcio. generalmente piccole molecole sintetiche come il fura si legano al calcio e poi lo rilasciano molto velocemente e quindi ti permettono di vedere variazioni molto veloci nel livello di calcio.
Indicatori a base proteica come pericam e cameleon invece sono più lenti perchè tutta la struttura proteica deve cambiare durante il legame col calcio e quindi non riescono a "star dietro" a cambiamenti troppo rapidi |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
kiko6361
Nuovo Arrivato
Città: Verona
37 Messaggi |
Inserito il - 03 novembre 2008 : 11:24:22
|
ok ho capito. Secondo voi per misurare al posto del Calcio il Cloro potrei usare sonde come ANEPPS? Le conoscete? Finora ho provato con Disbac2, ma vorrei passare ad una fast dye. Suggerimenti?
Grazie |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 03 novembre 2008 : 15:09:02
|
Per il cloro potresti provare MQAE, che sarebbe N-(ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide
Questa sonda è anche utilizzabile con un microscopio a 2 fotoni se sei così fortunato da averne uno a disposizione!
MQAE è un indicatore non raziometrico, se ne vuoi uno raziometrico potresti pensare a Clomeleon che però è geneticamente codificato ed ha cinetica più lenta di MQAE
|
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
kiko6361
Nuovo Arrivato
Città: Verona
37 Messaggi |
Inserito il - 04 novembre 2008 : 10:37:18
|
A dir il vero la mia intenzione non è usare un microscopio ma un conter multilabel e per la precisione il VICTOR della Perkin Elmer. Con il Disbac2, al microscopio, misuro benissimo il Cl...invece ripetendo lo stesso esperimento al Victor non ottengo niente e mi viene il nervoso!!  Vorrei provare a cambiare la sonda. |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
|
|
kiko6361
Nuovo Arrivato
Città: Verona
37 Messaggi |
 Inserito il - 04 novembre 2008 : 12:34:35
|
| GRAZIE! |
|
|
|
kiko6361
Nuovo Arrivato
Città: Verona
37 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2009 : 12:28:41
|
Ciao ho comperato MQAE di invitrogen. C'è scritto cheè moderatamente solubile in acqua ma vorrei sapere se posso scioglierlo in DMSO. Qaulcuno me lo sa dire? La formula è: C14H16BrNO3
Grazie |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
|
|
kiko6361
Nuovo Arrivato
Città: Verona
37 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2009 : 11:14:21
|
Sul sito della invitrogen c'è scritto che MQAE è solubile in acqua ma su altri siti (stessa formula) dicono anche in DMSO...provo e vi saprò dire!
This dye detects the ion via diffusion-limited collisional quenching.
Domanda: cioè? Non capisco se con la sonda MQAE io vedrò un abbassamento di fluorescenza durante la curva cinetica che mi misura il Cl. |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2009 : 19:28:11
|
Sì, esatto, hai quenching in presenza di Cl-.
Il "diffusion limited collisional quenching" vuol dire che in pratica questo quenching NON avviene per legame del Cl- con la sonda, il che è una buona cosa, in quanto non hai buffering del Cl- da parte della sonda stessa. |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
| |
Discussione |
|
sonde fluorescenti e raziometriche
Didattica
