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blybos
Nuovo Arrivato
Prov.: Padova
Città: Padova
12 Messaggi |
 Inserito il - 26 febbraio 2009 : 17:09:34
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Ciao a tutti!
Ho un problemino da porvi e spero che qualcuno di voi mi possa aiutare.
Devo amplificare una sequenza inserita in un vettore ed aggiungere in coda ai primer dei siti ri restrizione specifici per il vettore in cui poi dovrò riclonarlo,perciò fissi e non modificabili.Inoltre la mia sequenza è piuttosto lunga(più di 2000bp)il che può complicare la riuscita della PCR.
Altro punto:nel disegnarmi i primer a mano purtroppo ho zero elasticità perchè devo far combaciare tutti i siti di restrizione e l'inizio e fine della sequenza,che devono essere contigui.Perciò mi capita di disegnare primer che però possono dimerizzare...chi mi sà dare qualche dritta su accorgimenti da prendere?
HELP! Credo che tra poco inizierò a parlare a triplette...
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Ema |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2009 : 17:19:37
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Beh se non puoi evitare che formino dimeri, non puoi fare altro.
Comunque fai la tua PCR magari aumentando la quantità di primers e vedi se ottieni la banda. Poi puoi sempre purificare la banda da gel lasciando li i dimeri di primers per il clonaggio sucessivo.
Guarda io tempo fa ho utilizzato il sistema Gateway, e i primers avevano perforza delle lunghe sequenze (attB) che erano perfettamente complementari tra loro.
Migrando su gel avevo delle grosse "nuvole" di dimeri di primer, ma comunque ho estratto il mio amplificato da gel e ho continuato con gli step successivi.
2000bp non è una grandezza così elevata, è fattibilissimo, aumenta i tempi di estensione (in genere 1min/kb), oppure utilizza polimerasi per templati lunghi.
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blybos
Nuovo Arrivato
Prov.: Padova
Città: Padova
12 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2009 : 18:38:50
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Grazie mille davvero,terrò presente i tuoi consigli!
Buona serata! |
Ema |
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blybos
Nuovo Arrivato
Prov.: Padova
Città: Padova
12 Messaggi |
Inserito il - 27 febbraio 2009 : 17:22:02
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| Ho ancora un dubbio...se io devo creare una proteina di fusione con una porzione di proteina fluorescente e colloco quest'ultima a valle della prima, devo anche inserire la specifica sequenza di kozak della mia proteina fluorescente all'inizio della sua sequenza? |
Ema |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 febbraio 2009 : 21:09:25
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No! Fai una "proteina di fusione" quindi "fondi" anche i codoni della tua proteina con quelli della proteina fluorescente. La proteina generata sarà una sola.
Ovviamente devi eliminare il codone di stop della tua proteina altrimenti ottieni solo la tua proteina e non una proteina di fusione.
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Amplificazione da vettore
Didattica
