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maia84
Nuovo Arrivato

43 Messaggi

Inserito il - 26 marzo 2009 : 11:35:36

Ciao a tutti!
Sapreste indicarmi un sistema che mi permette di valutare la quantit� di ATP(prodotto sia per fosforilazione ossidativa che attraverso vie cataboliche)presente all'interno delle cellule batteriche??
Grazie mille!

metionina
Nuovo Arrivato

Citt�: Cambridge

45 Messaggi

Inserito il - 26 marzo 2009 : 20:58:23

Che io sappia esiste il metodo della luciferasi.

In pratica si trattano i batteri con un tampone che contemporaneamente lisa e degrada le proteine: io usavo per i micobatteri Tris-EDTA e CTAB (ma non so con gli altri batteri con pareti meno spesse cosa si usi) e scaldavo un minuto a 100�C.
Poi al lisato con l'ATP cellulare estratta si aggiunge luciferasi e luciferina. La luciferasi � un enzima che usa l'ATP cellulare per ossidare la luciferina, e si ha contemporanea emissione di luce:

ATP + D-luciferin + O2 --> oxyluciferin + PPi + AMP + CO2 * light

la luce emessa � proporzionale all'ATP presente e viene misurata con un luminometro.

Insieme ai campioni si fanno anche le misura di alcuni standard a concentrazione di ATP nota. Bisogna farli ogni volta gli standard perch� la quantit� di luce emissa pu� variare di molto a causa di mille fattori.
Una volta che si hanno le misure di luce emessa dagli standard, si fa una curva e si interpolano i risultati con la quantit� di luce emessa dai campioni e si ottiene la concentrazione di ATP cellulare.

cos� avrai la concentrazione di tutta l'ATP presente nella cellula.

Se invece vuoi solo l'ATP prodotta dall'ATP cellulare allora � meglio fare delle vescicoli membranali invertite (si dice cos� in italiano??

), il procedimento � un po' diverso ma si usa comunque la luciferasi.

maia84
Nuovo Arrivato

43 Messaggi

Inserito il - 29 marzo 2009 : 16:27:16

Potrebbe essere un buon sistema in effetti...
Dato che tu hai gi� avuto modo di utilizzare questa tecnica ti dispiacerebbe inviarmi il protocollo che hai usato? Grazie in anticipo!

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 29 marzo 2009 : 16:33:17

E se hai tempo lo puoi anche aggiungere nella sezione protocolli del sito

?

Grazie.

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metionina
Nuovo Arrivato

Citt�: Cambridge

45 Messaggi

Inserito il - 29 marzo 2009 : 16:39:40

dovrei gi� avere un protocollo pi� o meno scritto... appena ho un attimo lo aggiungo!