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stepbiotech
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
 Inserito il - 08 aprile 2009 : 13:51:54
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ciao a tutti, ho alcuni dubbi sul mio segnale grezzo ottenuto per FAM con un Rotorgene 3000A.
le mie amplificazioni salgono attorno al Ct desiderato ma poi non hanno una buona salita e mi tendono ad andare a plateau a livelli non soddisfacenti di unità di Fl.
Vi allego uno screenshot del canale FAM grezzo.
bye
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bellastoria
Nuovo Arrivato
Prov.: Bayern
Città: wuerzburg
21 Messaggi |
 Inserito il - 08 aprile 2009 : 17:00:29
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Hai un conttrollo positivo anche? Anche questo ha una fluorescenza non adeguata??
Sono sufficienti le quantità di primer?
Mi sembrerebbe qualcosa con i primers oppure sulla quantà di nucleotidi non sufficiente.... ma è solo una supposizione...
F.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 08 aprile 2009 : 17:21:20
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| Si anche a me la cosa che verrebbe subito da pensare è una quantità insufficiente di qualche reagente della PCR. |
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scienza 82
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
Inserito il - 08 aprile 2009 : 17:47:11
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Ciao anche a me sembrerebbe la stessa cosa....
io uso i primers a 300 micromolare e la sonda a 200 micromolare ...in un volume sia di 50 che di 25 microlitri e viene bene..... |
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stepbiotech
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 10 aprile 2009 : 12:44:35
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si, sono 3 controlli positivi e alcuni campioni positivi al target.
quello a cui ho pensato io è proprio un problema di primers, dato che l'enzima che utilizzo è una premix standardizzata e che in altri sistemi non mi da questi problemi...
aumentare primers?? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 10 aprile 2009 : 17:22:09
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Citazione:
Messaggio inserito da stepbiotech
si, sono 3 controlli positivi e alcuni campioni positivi al target.
quello a cui ho pensato io è proprio un problema di primers, dato che l'enzima che utilizzo è una premix standardizzata e che in altri sistemi non mi da questi problemi...
aumentare primers??
Si se tutto il resto è una mix prova ad aumentare i primers, e magari fai anche una prova con una PCR end point per vedere se su gel vedi dimeri di primers, e prova ad analizzare i primers con programmi appositi per vedere se possono formare dimeri.
Se tendono a formare dimeri avrai meno primer disponibile per la PCR.
La causa potrebbe essere questa. |
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stepbiotech
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 17 aprile 2009 : 10:17:50
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qualche dimero c'è in effetti.. ora provo a modificare solo uno dei due primer perchè probabilmente è limitante per la reazione. Anche se la banda su gel mi sembra buona come intensità!!
proverò poi anche ad aumentare un poco la sonda, anche se non penso di avere netti miglioramenti, ma non si sa mai...  |
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