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blybos
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 Inserito il - 28 aprile 2009 : 12:53:40
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Buongiorno a tutti!
Avrei bisogno di un aiuto per quanto riguarda il clonaggio di un inserto codificante per una proteina di mio interesse all'interno di un vettore per l'espressione. Il procedimento che seguo è il solito:
-pcr per amplificare il gene utilizzando primer contenenti al 5' una sequenza riconosciuta da enzimi di restrizione
-digestione inserto e vettore
-defosforilazione vettore
-ligazione
-trasformazione.
Il problema è che i batteri in selezione non crescono,ossia non sviluppano la resistenza. Che vuol dire? Quali possono essere tutti i tipi di problema che possono sorgere nella procedura?
Mi hanno suggerito che probabilmente i 2 tipi di batteri che ho usato in qualche modo riarrangiano il vettore che risulta essere tossico per loro e ne impedisce la crescita:potrebbe essere una soluzione quella di cambiare vettore d'espressione?
Grazie a chi mi può aiutare!
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 28 aprile 2009 : 13:52:42
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Non so quanta esperienza hai a tale riguardo...
Non è proprio semplice se non hai un minimo di basi solide in clonaggi.
Dovresti tener conto di alcuni concetti basilari che non so se li conosci:
1) Il punto più cruciale è la digestione enzimatica del prodotto di PCR, in genere è difficile, se è un'estremità di DNA ancora più difficile (dovresti lasciare un numero di basi all'estremità per consentire all'enzima di 'aggangiarsi' al DNA 2-8 bp) trovi queste info sul catalogo NEB che consiglia anche quali basi sono più facilmente riconoscibili dal tuo enzima.
2a) Alcuni non purificano dopo la digestione enzimatica, tanto si eliminano poche basi e non possono rilegarsi al frammento... tuttavia devi ricordarti comunque di eliminare l'enzima di restrizione per inattivazione, se possibile, o purificare la PCR dai sali ed enzima
2) se il frammento di PCR è < 1000 bp potresti rischiare di denaturarlo in seguito alla purificazione da gel o cloroformio/fenolo. Non usare mai acqua distillata senza sali
3) potresti avere la polimerizzazione del frammentino di PCR durante la ligasi, carica una aliquota su gel, (contenenti almeno 5-10ng di frammento) e vedi se polimerizza tutto (se polimerizza significa che la digestione enzimatica è andata bene, se raddoppia il peso molecolare solo un'estremità è stata tagliata bene).
4) se il frammento è tagliato bene e polimerizza bene, potresti tentare vari rapporti molari di frammento vs vettore tagliato
Il riarrangiamento avviene ed è fastidioso perché dà resistenza agli antibiotici e fa crescere i batteri resistenti, nel tuo caso non è un problema, a meno che tu non abbia vettori intorno ai 10 kb.
in bocca al lupo
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 28 aprile 2009 : 13:52:52
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ciao
beh si potrebbe essere quello che ti hanno suggerito
ma....
1) e' un vettore di espressione comune?...
2) i batteri che usi li hai gia' usati per altri clonaggi?
se i batteri gia' son testati e funzionano e il vettore e' comune
credo sia piu un problema di ligazione
probabilmente nn funziona e quindi nn hai il vettore ligato e nn cresce nulla
a volte capita....
che ligasi usi? e come la usi?
sicuro che hai messo la giusta proporzione vettore/inserto?
sicuro che il vettore sia ben tagliato?
che polimerasi usi per amplificare il prodotto PCR?
inoltre nn so se sia necessario defosforilazione vettore
io non lo faccio
e funziona benissimo il clonaggio
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blybos
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12 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2009 : 10:07:18
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In effetti sono un pò alle prime armi...
Comunque, i primer che ho costruito hanno almeno 2 nucleotidi di protezione, anche se non ho controllato il catalogo degli enzimi, li ho aggiunti prevalentemente per aggiustare le temperature di melting e il gc content.
Purifico sempre da gel dopo la digestione, anche se non ho mai fatto il controllo di avere effettivamente il frammento, ma misurando l'assorbanza vedo che ho dna,anche se in quantità a volte ridicole...
Ho provato a caricare un controllo dopo la ligazione,ma non vedo assolutamente nessuna banda, corsia pulita, e non so darmene una spiegazione.
Uso la ligasi della NEB, la t4 e finora ho provato solo il rapporto 1vettore:3inserto perchè era quello consigliato da un quik kit di ligation,farò prove utilizzandone altri, magari tra 1 e 10 eccesso molare di inserto.Seguo il protocollo del data sheet e lascio ad incubare 15 min a 25°, come consigliato, poi trasformo.
Ho usato 2 tipi di batteri, bl21 e dh5alfa,l'unica volta che mi è cresciuto qualcosa è stato con questi ultimi, che però poi dopo controllo è risultato che contenevano il vettore non ricombinato che forse mi sono portata dietro dopo un'estrazione da gel(forse è migrato insieme al digerito).Il vettore che sto usando è stato acquistato sul sito della evrogene e contiene un tagYFP al c-end della proteina che vorrei inserire.
I batteri hanno sempre funzionato con altri esperimenti e la polimerasi anche.Pensi sia il caso di usarne una ad alta fedeltà anche se il mio frammento non è poi così lungo(circa 600bp)?
Non so veramente più che provare... |
Ema |
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2009 : 10:40:28
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ciao
si il rapporto 1:3 e' ottimale
e se come dici hai concentrazioni ridicole di DNA dopo la purificazione da gel (cosa normalissima... io ho di solito 60ng/ul in 30ul di eluito finale)
e' normale che dopo la ligazione nn vedi nulla sul gel
per la T4... io uso una di roche che dice da datasheet di lasciare 15 minuti a 25 gradi
ma da esperienza nel mio lab e in altri
sempre la lasciamo overnight a temperatura ambiente
e ho provato un T4 di un altro kit (un giorno che era finita questa) e non so perche' ma non ha funzionato
quindi vedi bene che T4 hai e se e' gia stata usata per ligare
prova a fare questa variante e vedi se funziona
comunque ti consiglio sempre di ricominciare tutto da capo
lo so che e' una scocciatura
ma meglio rifare una PCR e ritagliare il plasmide
e poi di nuovo riprovare la ligazione ma overnight
e per le PCR.. non usare la TAQ.. perche' aggiunge sempre una base alla fine dell'amplificato che potrebbe poi interferire con la digestione
usa una Pfu o altre simili
per i batteri.... Bl21 sono i classici e se hanno funzionato in precedenza
io non li cambierei
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blybos
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Inserito il - 29 aprile 2009 : 11:02:34
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| Scusa l'ignoranza...ma che differenza c'è tra i 2 enzimi? Io sto usando una taq high fidelity e in teoria, a meno che non ci siano misincorporation errors a livello della sequenza di restrizione, l'enzima dovrebbe tagliare ugualmente. |
Ema |
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2009 : 11:12:14
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la taq aggiunge sempre una base (non mi ricordo quale.. mi sembra la A) alla fine dell'amplificazione
e' un suo difetto
mentre la Pfu non lo fa
quindi con la taq ti ritrovi un amplificato pcr che ha le tue sequenze degli anzimi di restrizione piu la base finale che ha aggiunto
questo puo' interferire con la digestione enzimatica
di solito per questo motivo non si usa la Taq per fare clonaggio
ma si una la Pfu o similari
quindi altro consiglio
prova a fare tutto con Pfu e vedi se funziona
io non conosco persone che usano la Taq per clonare
ma puo' essere che funziona lo stesso
ma io sempre ho usato la Pfu e non ho mai avuto problemi
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blybos
Nuovo Arrivato
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12 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2009 : 11:16:00
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Nel mio lab altri usano la taq e non hanno problemi,cmq proverò.
Ti ringrazio infinitamente, sei stato gentilissimo!
Buona giornata! |
Ema |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2009 : 14:18:49
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Per quanto conta devo dissentire da quello che è stato scritto da miky76. Spero non si offenda per quello che sto per scrivere io... diciamo che è un altro punto di vista. Il tempo magari darà ragione ad uno di noi oppure darà torto ad entrambi.
1) il rapporto 1:3 non è sempre ottimale, dipende dalle circostanze, dai vettori e dalle dimensioni del frammento/vettore. Io farei altri rapporti per essere sicuro
2) 60ng/ul in 30ul di eluito finale è una quantità considerevolmente alta, su gel riesci a vedere 5 ng se sei esperto, 10 ng se non lo sei.... basta meno di 1 microlitro per vedere bene la banda. Ripeto è una quantità di tutto rispetto per un eluito
3) NON e' ASSOLUTAMENTE normale che dopo la ligazione nn vedi nulla sul gel... il DNA, se non digerito, deve stare da qualche parte, se lo carichi su gel si DEVE vedere a meno che non carichi una quantità di DNA estremamente bassa (<5 ng).
Per una ligasi in batteri chimicamente competenti in genere si usano 100 ng di DNA ligato in 10-20 microlitri, quindi anche solo 1 microlitro di ligasi (corrispondente a 5-10 ng) dovrebbe essere visto su gel di agarosio, se ne carichi 5 dovresti vedere cosa è successo... è un ottimo metodo per verificare se la ligasi ha funzionato, se hai defosforilato il vettore e se il tuo frammentino è stato digerito bene (cosa che dubito con sole 2 basi di protezione)
4) Ligasi o.n. a 4°C o 15 minuti a temperatura ambiente... differenza davvero poca, in genere i frammenti molto piccoli si ligano meglio a 4°C per una questione di annealing... io in genere vado dai 5-7 minuti, quello che non succede in 10-15 minuti non succede o.n.... fidatevi o fate una prova voi stessi.
5) Io userei la Pfu per una questione di maggiore accuratezza dell'amplificato... il fatto che la Taq aggiunga una A dopo 2 basi di protezione non cambia un granché ai fini della digestione
Nella maggioranza dei casi si usa la Pfu per una questione di maggiore fedeltà del trascritto, non certo perché NON aggiunge delle A alle estremità (sarebbe molto utile se lo facesse ai fini di un clonaggio).
Tuttavia bisogna considerare che 600 bp potrebbero anche passare per la Taq, basta fare lo screening di un po' di cloni con il sequenziamento completo di tutta la sequenza... c'è una buona possibilità di avere qualche clone con la sequenza buona.
Se potessi dare un consiglio a blybos, le direi di non perdere tempo ad insistere, ma analizzare quello che ha fatto e soprattutto il punto più critico di questo suo clonaggio.
Credo che sia il taglio enzimatico della PCR che, considerando l'inesperienza, è il punto più probabile in cui si sia verificato il casino... dovresti ridisegnare i primers con più basi di protezione (vedi su catalogo NEB) ed aumentare la quantità di enzima di restrizione ad almeno 10-20 Unità per microgrammo di DNA per diverse ore.
Per verificare l'efficacia di digestione...
fai una nuova PCR-> Estrazione da gel->Verifica di aver eluito correttamente-> 50% digestione con enzima almeno 10U per ogni microgrammo di DNA, 50% lo metti solo nel buffer dell'enzima di digestione senza tagliare niente.
Carichi su gel entrambi ed estrai->Riverifica l'estrazione SEMPRE
Prova a ligare il frammento di PCR da solo (circa 50-100 ng) (10 minuti), quello digerito da una parte e quello non digerito dall'altra. Carica su gel tutta la ligasi per entrambi i campioni.
Se la digestione viene bene dovresti avere una sola banda di 600 bp nel pozzetto del non digerito ed una banda a 10.000 bp nel digerito e ligato più altre bande intermedie.
Nel caso la digestione non sia venuta avrai entrambi i campioni uguali, singola banda a 600 bp.
Con sole 2 basi di protezione ci sono solo pochi enzimi di restrizione capaci di fare una buona digestione, tra quelli che ho usato sicuramente ci sono ricordo Asc I, Ava I, Cla I, EcoR I, Kpn I, Stu I, Xba I... L'efficacia della digestione non la ricordo bene, ma nessuno ha mai brillato nella digestione con sole 2 basi di protezione.
anche aggiungendo una A alla fine, 2 basi di protezione sono troppo poche per una buona digestione e clonaggio.
In bocca al lupo
Pasquale |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2009 : 16:13:21
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Citazione:
3) NON e' ASSOLUTAMENTE normale che dopo la ligazione nn vedi nulla sul gel... il DNA, se non digerito, deve stare da qualche parte, se lo carichi su gel si DEVE vedere a meno che non carichi una quantità di DNA estremamente bassa (<5 ng).
Per una ligasi in batteri chimicamente competenti in genere si usano 100 ng di DNA ligato in 10-20 microlitri, quindi anche solo 1 microlitro di ligasi (corrispondente a 5-10 ng) dovrebbe essere visto su gel di agarosio, se ne carichi 5 dovresti vedere cosa è successo... è un ottimo metodo per verificare se la ligasi ha funzionato, se hai defosforilato il vettore e se il tuo frammentino è stato digerito bene (cosa che dubito con sole 2 basi di protezione)
Io ho provato per due volte a caricare il prodotto di ligazione
e non ho mai visto nulla, anche se le trasformazioni dopo sono
riuscite perfettamente. A parere di gente del mio lab la colpa
è del tampone della ligasi, che fa precipitare il DNA nel pozzetto
o comunque non permette una corretta migrazione. In teoria avrei
dovuto vedere una banda di circolarizzato e una di linearizzato
(visto che l'efficienza di ligazione non è del 100%) ma in pratica
ho sempre visto una striscia di precipitato. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2009 : 16:34:47
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Con sole 2 basi di protezione ci sono solo pochi enzimi di restrizione capaci di fare una buona digestione, tra quelli che ho usato sicuramente ci sono ricordo Asc I, Ava I, Cla I, EcoR I, Kpn I, Stu I, Xba I... L'efficacia della digestione non la ricordo bene, ma nessuno ha mai brillato nella digestione con sole 2 basi di protezione
il clonaggio ognuno lo fa con la propria esperienza
io ho sempre primers con solo 2 basi di protezione
e ho tagliato con EcorI... HindIII... BglII... NotI... KpnI
senza mai problemi di digestione
ottime rese
certo sempre ponendo la giusta quantita' di enzima per quanto DNA ponevo a digerire
ma questo lo trovi sul datasheet di ogni enzima
e come dice Dionysos.. io non ho mai visto il prodotto di ligazione
supponevo che era per la poca concentrazione di DNA che metto sul gel
io uso solo un normalissimo tranilluminatore con risoluzione ad occhio
ma forse la spiegazione e' quella che ha dato Dionysos
per il resto
segui i consigli di neuroscience
e in bocca al lupo |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2009 : 17:21:56
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Citazione:
io ho sempre primers con solo 2 basi di protezione
e ho tagliato con EcorI... HindIII... BglII... NotI... KpnI
senza mai problemi di digestione
ottime rese
Beh miky76, comunque è abbastanza noto che le basi
necessarie all'estremità per ottenere un buon taglio
dovrebbero (diciamo che è meglio) essere più di 2
affinchè l'enzima possa sedersi bene sul DNA.
Il maniatis consiglia 7-8 basi. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2009 : 17:52:03
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lo so che consigliano 8 basi minimo
ma io ho sempre usato primers che al 5^ ha solo 2 paia di basi dal sito di restrizione
e ho sempre ottenuto cloni
era solo per dire a blybos di non ridisegnare i primer subito
ma prima fare le altre prove
e se proprio nn funziona nulla
rifare i primer con le indicazioni che avete detto
un altra cosa per blybos
una cosa che mi e' venuta in mente ora
il prodotto PCR dopo essere stato digerito con gli enzimi
lo usi direttamente per la ligazione?
perche' molti buffer di restrizione enzimatica
inibiscono la T4
era un altra possibilita'
ripeto.... ognuno fa il clonaggio come lo apprende in lab
e ogni lab usa metodi differenti
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2009 : 19:26:07
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Il fatto che voi non vediate le bande della ligasi non è tanto normale.
Non credo alla precipitazione del DNA nel pozzetto, poiché non ho mai visto un tampone tanto strano da poter tenere in soluzione il DNA, consentire la trasformazione e precipitare in TBE 
Ad ogni modo, caricare la ligasi prima della trasformazione non è obbligatorio ma utile per capire se la ligasi ha funzionato o no. Personalmente lo faccio sempre e ho sempre visto il DNA, ammesso di averne messo la quantità minima opportuna...
ad esempio una ragazza che faceva la tesi con me utilizzava circa 45 ng di vettore e 2-3 ng di inserto per la ligasi, ma quando caricava su gel non vedeva mai niente... ho visto però che non c'era neanche il controllo negativo della ligasi (vettore+ frammento senza ligasi)
poi ho scoperto che in realtà caricava su gel 1 microlitro della ligasi, ovvero la stessa quantità che usava per la trasformazione ... facendo un po' di calcoli praticamente nel gel c'erano solo 2 ng di vettore separati in varie bande e una quantità infinitesimale di frammento...
Non conta la concentrazione della ligasi, ma la quantità che metti su gel... se metti in 2 provette il DNA, uno con la ligasi ed uno senza, poi li carichi su gel il DNA ci deve essere.
Se precipita, si degrada o scompare misteriosamente c'è qualcosa che non va.
Fate BENE il calcolo di quanto vi aspettereste di vedere su gel di agarosio, se sono meno di 10 ng di banda ci vuole un'ottima esperienza per vederle. Contate che se non defosforilate il vettore, esso polimerizza e ciclizza, quindi il risultato è quello di avere diverse bande ad altezze multiple del peso molecolare originario. Ad esempio, se il totale di DNA del vettore messo su gel è 20 ng, ma si formano 10 bande diverse non si possono apprezzare poiché sarebbero (circa) 2 ng ciascuna.
Per vedere bene le bande, senza avere molta esperienza, dovreste mettere non meno di metà ligasi, circa 50 ng, di vettore e di frammento su gel per vederlo bene.
Poi mi direte se precipita il DNA nel pozzetto o migra
Se volete vi faccio vedere le migliaia di foto di ligasi, Takara, T4 Neb, e credo anche la Roche.
Non sempre l'ho fatto per i clonaggi, in alcuni casi ho fatto ligasi per unire due tratti di DNA, in altri casi era un'analisi diagnostica per verificare se l'enzima aveva digerito bene o aveva degradato l'estremità coesiva.
Si tratta di un esperimento davvero banale che fanno i miei tesisti tutti i giorni, non penso siano speciali per vedere o far comparire le bande della ligasi e non penso siano speciali le ligasi che usano.
P.S.: anche io, come premesso prima ho fatto tagli con enzimi di restrizione su PCR con protezioni di 2 basi, però avevo premesso che è una cosa un po' delicata che può risultare ostico ad una esperienza superficiale... In questo caso mi pare che il passaggio più delicato sia quello, non conoscendo l'enzima, la quantità che ne ha usato per la digestione ed il tempo di incubazione... immagino che ci possano essere stati degli errori in quel punto.
Nella mia esperienza non posso escludere tutti i buffer di digestione, ma almeno sono sicuro che la ligasi T4 ed anche la Takara funzionano bene in tutti i buffer NEB (1, 2, 3, 4, EcoRI, BamHI) e Roche (A, B, L, H) purché si aggiunga l'ATP alla giusta concentrazione finale. Credo che sia descritto anche sul manuale NEB per la T4, per la Takara credo che non ci sia mensione di ciò.
P.P.S.: il catalogo NEB descrive che Hind III con 2 basi di protezione ha un'attività di taglio dello 0% dopo 20 ore di incubazione, idem per Not I... forse dipende dal rapporto enzima/DNA (o dalla casa che produce l'enzima?)
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2009 : 22:50:10
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Citazione:
Non credo alla precipitazione del DNA nel pozzetto, poiché non ho mai visto un tampone tanto strano da poter tenere in soluzione il DNA, consentire la trasformazione e precipitare in TBE
E' un tampone che serve solo all'enzima ligasi, non ha effetto
sulla trasformazione visto che quando la fai diluisci il ligato
in un volume molto più grande di sospensione batterica.
Io usavo TAE, non so se è il tampone elettroforetico in sé,
ma quello che ho visto assomigliava proprio a precipitato
(forse il tampone ha cationi bivalenti? magnesio?)
Citazione:
Fate BENE il calcolo di quanto vi aspettereste di vedere su gel di agarosio, se sono meno di 10 ng di banda ci vuole un'ottima esperienza per vederle
Intendi dire un ottimo transilluminatore? :P
Comunque c'è anche la probabilità che il DNA caricato
sia "troppo", nel senso che eccede il prodotto di
solubilità e quindi non migra come dovrebbe
(oppure non migra affatto). In tal caso non è che
non vedi proprio nulla, ma noti una striscia di segnale
non migrata correttamente o accumulata vicino al pozzetto.
A me succedeva esattamente così...
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2009 : 22:51:20
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Citazione:
Se volete vi faccio vedere le migliaia di foto di ligasi, Takara, T4 Neb, e credo anche la Roche.
Non è che non ti credo :D ci mancherebbe,
non star lì a postare "migliaia" di foto :P |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 30 aprile 2009 : 10:54:46
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P.P.S.: il catalogo NEB descrive che Hind III con 2 basi di protezione ha un'attività di taglio dello 0% dopo 20 ore di incubazione, idem per Not I... forse dipende dal rapporto enzima/DNA (o dalla casa che produce l'enzima?)
non so che dirti
io l'ho fatto e ha funzionato benissimo
enzima fermentas e 37gradi per 1 ora
ma alla fine della doppia digestione (EcoRI/HindIII)
ho precipitato e risospeso in acqua per avere un prodotto da usare per la ligasi piu pulito
ma per esperienza diretta... molte cose che sono scritte nei cataloghi
non sempre sono vere
e per il fatto che nn vedo il prodotto ligasi sul gel
ho provato solo 1 volta
e forse o sicuramente ho sbagliato a fare i calcoli e ho messo una quantita' troppo piccola per essere vista
ma di solito non faccio questo passaggio perche' fino ad ora
i clonaggio sono sempre venuti
questione di fortuna!
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 30 aprile 2009 : 14:44:06
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...e con questa chiudo.
>Io usavo TAE, non so se è il tampone elettroforetico in sé,
>ma quello che ho visto assomigliava proprio a precipitato
>(forse il tampone ha cationi bivalenti? magnesio?)
Il TAE è composto da TRIS, Acido Acetico, EDTA,
quindi non dovrebbe avere ioni bivalenti in soluzione,
se è come dici, ovvero il DNA si diluisce tanto e quindi non precipita nei batteri, ancora di più dovrebbe valere per il TAE o TBE che serve proprio per migrare il DNA per la massima solubilità possibile.
Direi che la precipitazione di una ligasi in buffer di corsa è una cosa anomala, ad ogni modo si potrebbe sempre purificare il DNA prima di caricarlo.
Non escludo la possibile formazione di un precipitato di DNA nel tuo caso, ma sarebbe un'interessante cosa da capire... quale buffer di ligasi, quanto DNA, quando grande, buffer di corsa etc... insomma un protocollo dettagliato. Tuttavia per ora non c'è tempo e non è argomento di discussione.
>Intendi dire un ottimo transilluminatore?
No, semplicemente un ottimo occhio e sapere quello che stai cercando.
>Comunque c'è anche la probabilità che il DNA caricato
>sia "troppo", nel senso che eccede il prodotto di
>solubilità e quindi non migra come dovrebbe
>(oppure non migra affatto). In tal caso non è che
>non vedi proprio nulla, ma noti una striscia di segnale
>non migrata correttamente o accumulata vicino al pozzetto.
>A me succedeva esattamente così...
Dovrebbe succedere ancora di più nelle digestioni preparative per i clonaggi, dove si caricano su gel microgrammi di DNA da far migrare...
In una ligasi quanto metti? più di un microgrammo di DNA?
>ma di solito non faccio questo passaggio perche' fino ad ora
>i clonaggio sono sempre venuti
>questione di fortuna!
Fortuna o Bravura... beato te!
A me per far venire certi clonaggi devo insistere davvero tanto... spesso con più tecniche.
ora vado che ho già riempito il forum di pagine di parole inutili
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blybos
Nuovo Arrivato
Prov.: Padova
Città: Padova
12 Messaggi |
Inserito il - 03 maggio 2009 : 23:44:29
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Cavolo!
Non credevo di sollevare un così acceso dibattito!
Cmq domani tornerò in lab,terrò presente ogni vostra opinione e poi elaborerò una strategia per il mio clonaggio.
Prometto di tenervi informati sul risultato!
Grazie a tutti! |
Ema |
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 04 maggio 2009 : 11:19:50
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ciao
a me questa discussione e' piaciuta molto
si impara sempre dai dibattiti
e neuroscience non ha riempito il forum di pagine inutili
al contrario
in bocca al lupo
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Discussione |
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