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GiorgiaB
Nuovo Arrivato

4 Messaggi

Inserito il - 05 maggio 2009 : 23:01:43

Ciao, mi sono appena iscritta a biotecnologie e avrei bisogno di qualche dritta per questi quesiti:

1. Voglio produrre in grandi quantit� un polipeptide idrofilico, del peso di 25 kDa, che sar� utilizzato come farmaco per la cura di una malattia. Dispongo del cDNA di questo polipeptide.
Descrivere per punti la strategia che si intende adottare per produrre e purificare efficacemente il polipeptide tenendo conto dei possibili problemi a cui si pu� andare incontro e delle eventuali soluzioni;

2. Mediante l'uso di una sonda omologa ho operato lo screening di una libreria di cDNA alla ricerda del clone codificante una proteina di 60KDa espressa nel fegato di topo che voglio produrre in forma ricombinante. Ho purificato un clone che, opportunamente digerito con enzimi di restrizione, � risultato lungo circa 2100 bp.
Ritiene che questo frammento costituisca il cDNA della proteina che sto cercando? In caso positivo o negativo come pensa di continuare l'analisi?

3. La fibrosi cistica � dovuta alla mutazione del gene (completamente sequenziato) CFTR. La mutazione R1162ter provoca il cambiamento della tripletta CGA (Arginina) nella tripletta UGA (tripletta di stop); questa mutazione causa anche la comparsa di un sito di restrizione per l'enzima DdeI.
Quale procedura pu� essere usata nella diagnosi prenatale? Su quale principio si basa e come si interpreta il risultato?

Grazie mille!

gilthanas
Nuovo Arrivato

100 Messaggi

Inserito il - 09 maggio 2009 : 22:42:02

Ti rispondo al quesito n� 3....

La procedura che si usa in genere � una procedura di screening basata su PCR seguita da digestione.
Si fa una PCR specifica sull'intero cDNA del gene CFTR, o su di una porzione comprendente la mutazione, sul cui prodotto di amplificazione vene esweguita una digstione con l'enzima di restrizione DdeI.
L'enzima digerir� quindi il prodotto di PCR in due di pi� piccole dimensioni rispetto al frammento wt.
Un individuo eterozigote per tale mutazione avr� tutte e tre le bande: una pi� grande corrispondente all'allele wt (che non contiene nessuna sequenza bersaglio per l'enzima di retrizione) e altri due pi� piccoli corrispondenti all'allele mutato.
omozigote wt solo 1 banda
omozigote mutante per quella mutazione (molto raro in questo caso) solo le 2 bande pi� piccole

GiorgiaB
Nuovo Arrivato

4 Messaggi

Inserito il - 10 maggio 2009 : 09:55:12

Grazie!