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ElisabettaCardiff
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 13 maggio 2009 : 12:06:05
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Ciao!
Mi sono appena iscritta a questo forum, per dirla tutta e` la prima volta che mi iscrivo a un forum, quindi siate clementi!
Allora, io ho iniziato da poco ad utilizzare il PCR per valutare la presenza di canali del potassio all`interno di un paio di linee cellulari che sto sviluppando.
Ho fatto il PCR per due canali.
La banda corrispondente al primo era chiara, ma identificava una misura molto piccola, intorno ai 100bp. In realta` non so di preciso come verificare la taglia del mio risultato perche` li ho disegnati io tramite Primer3 e Emsenbl.
Non so neanche se siano sufficientemente specifici...e` che i primers gia` calcolati per i miei canali che i due siti mi davano erano collocati sullo stesso esone e in teoria, ditemi se mi sbaglio, vanno evitati per problemi di risonanze...di altre bande intendo.
Comunque,onostante li abbia disegnati su due esoni differenti, sul secondo canale il PCR mi ha dato 4 bande in piu` oltre la mia, che non so quale sia perhce` non riesco a calcolare la taglia.
Insomma aiutatemi a capircene qualcosa.
Riassumo:
1)la banda di un canale probabilmente troppo piccola, ma non so calcolare la taglia presunta
2)troppe bande per l`altro canale e non so quale sia quella del risultato vero.
Mi scuso per la scarsa prprieta` di linguaggio, ma i termini italiani proprio non li so...sono in un`universita` in UK!
Grazie a chi avra` il buon cuore di aiutare una povera principiante!!!
Betta
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 13 maggio 2009 : 12:39:29
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Citazione:
La banda corrispondente al primo era chiara, ma identificava una misura molto piccola, intorno ai 100bp. In realta` non so di preciso come verificare la taglia del mio risultato perche` li ho disegnati io tramite Primer3 e Emsenbl
Una volta che sai dove si legano i primer trovi la taglia per differenza. Ad es. se i primers si legano sulle posizioni 57 e 147 avrai una banda di 90bp.
Sul gel poi trovi la lunghezza della banda comparandola con il marker.
Citazione:
Non so neanche se siano sufficientemente specifici.
Conviene sempre fare un BLAST per vedere se i tuoi primer sono specifici. Puoi anche usare Primer BLAST per disegnarli, che ti fa il BLAST direttamente (almeno credo... non ho ancora avuto occasione di usarlo)
Citazione:
i primers gia` calcolati per i miei canali che i due siti mi davano erano collocati sullo stesso esone e in teoria, ditemi se mi sbaglio, vanno evitati per problemi di risonanze...di altre bande intendo.
Sì, in effetti converrebbe farli su esoni diversi, o ancor meglio a cavallo di due esoni. Questo evita di amplificare DNA genomico che potrebbe essere rimasto nella preparazione (immagino tu stia facendo RT-PCR)
Citazione:
Comunque,onostante li abbia disegnati su due esoni differenti, sul secondo canale il PCR mi ha dato 4 bande in piu` oltre la mia, che non so quale sia perhce` non riesco a calcolare la taglia.
Puoi provare ad aumentare un po' la stringenza della PCR, ad es. aumentando un po' la T di annealing (a volte basta poco, anche 0.5-1 °C)
Citazione:
Mi scuso per la scarsa prprieta` di linguaggio, ma i termini italiani proprio non li so...sono in un`universita` in UK!
Figurati, conosco la situazione! L'unica cosa è che PCR è femminile! "la" PCR!!
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ElisabettaCardiff
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 13 maggio 2009 : 12:45:21
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Grazie!!!
Allora ora mi metto a seguire i tuoi consigli per LA PCR!
Probabilmente saro` ancora incasiantissima e mi sa che ti stressero` ancora!!!
Intanto GRAZIE!
Betta |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 13 maggio 2009 : 13:56:38
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Conviene sempre fare un BLAST per vedere se i tuoi primer sono specifici. Puoi anche usare Primer BLAST per disegnarli, che ti fa il BLAST direttamente (almeno credo... non ho ancora avuto occasione di usarlo)
Si fa il BLAST direttamente!
Anzi ti consiglio di utilizzarlo per controllare i primers che hai disegnato, ti dirà sia dove sia appaiano sulla tua sequenza sia la lunghezza del prodotto di PCR.
Inoltre nel caso i primers si possano appaiare a sequenze aspecifiche e darti altri prodotti te lo segnala, come potrebbe essere il tuo secondo caso.
Inoltre hai controllato che i primers non ti amplifichino anche DNA genomico? Anche quello potrebbe essere una possibilità.
Per il resto concordo con i consigli che ti ha dato chick80
Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Citazione:
Mi scuso per la scarsa prprieta` di linguaggio, ma i termini italiani proprio non li so...sono in un`universita` in UK!
Figurati, conosco la situazione!
Anche io! 
Sapessi i miei termini Finlandesi!
Non ti preoccupare il tuo Italiano è comprensibilissimo! 
Scrivi pure se dovessi avere altri dubbi. |
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