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stef2
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
 Inserito il - 05 giugno 2009 : 20:51:49
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Ciao a tutti, vi sottopongo un problema che ho avuto amplificando alcuni geni e spero possiate aiutarmi.
Ho effettuato una retrotrascrizione del mio RNA e quindi ho lavorato su cDNA per amplificare dei geni di mio interesse.
Ho ottenuto buoni risultati per quanto riguarda la PCR, però ho amplificato anche campioni che mi aspettavo essere negativi, ed inoltre, in qualche campione negativo ho avuto un segnale di amplificazione molto alto, come se fosse amplificato del DNA.
Per questo motivo, ho, successivamente, eseguito lo stesso esperimento su DNA, con gli stessi primers e stesse condizioni di PCR, ottenendo in alcuni casi bande di altezza notevole non corrispondenti ai size dei geni, ma, in altri casi amplificati della stessa altezza dei geni, cioè lo stesso segnale ottenuto lavorando con il cDNA.
1) Come è possibile spiegare questo?
2) Riesco a spiegarmi le bande alte (DNA contaminante, che mi "porto dietro" con l'estrazione dell'RNA e della retrotrascrizione), ma non le bande di aplificati alla stessa altezza, sia se utilizzo cDNA che DNA.
Vi prego aiutatemi!!
Quali accorgimenti posso adoperare?
Devo modificre il numero di cicli della PCR e le temperature di melting?
Grazie
a presto
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stef2 |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2009 : 00:43:42
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Scusa ma la prima cosa da fare sarebbe fare un trattamento con DNasi del tuo RNA, così eviti la contaminazione da DNA genomico!
Poi le bande possono essere spiegabili con il fatto che i primer si attaccano i vari punti sul DNA e ti danno bande di altezza diversa.
I primers come sono stati disegnati? Sono specifici per cDNA? Sono disegnati all'interno di esoni o a cavallo di 2 esoni? Hai fatto un blast? Puoi utilizzare anche Primer BLAST per controllare che i tuoi primers siano specifici!
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2009 : 10:55:31
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Strano che tu abbia un amplificato sul genomico pari a quello del cDNA ,puo' essere che siano solo degli aspecifici...
tuttavia è buona norma trattare l'RNA con DNAsi dopo l'estrazione ,
con cosa retrotrascrivi il cDNA ,con Oligo-dT ?
se ti è possibile perchè non provi a retrotrascrivere con un revers specifico i tuoi trascritti e amplificare con un revers più interno ?
Oppure fai una PCR senza cDNA,mettendoci al suo posto H2O,si sa mai che ti porti qualche contaminazione |
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stef2
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2009 : 15:17:14
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Per rispondere a GFPina, i primers li ho disegnati con PRIMER BLAST. Due sono all'interno dello stesso esone, uno non avevo scelta pechè è costituito da un solo esone, e gli altri sono tra 2 esoni. Sono specifici per il cDNA, praticamente ho inserito la sequenza tradotta nel primer design tool e da lì poi ho scelto quelli che potevano essere i più adatti. Ho fatto anche un allineamento tra le sequenze dei primers per vedere se potevano esserci annealing tra i primers. Questi poi dovranno rientrare in una futura multiplex PCR.
Invece, per rispondere a Patrizio, non ho trattato l'RNA con DNasi dopo l'estrazione, estrazione effettuatta con Trizol. Il cDNA lo retrotrascrivo con Random Examers ed ho già fatto la prova con l'H2O, non ho contaminazione, il campione risulta negativo. I size degli amplificati corrispondono a quelli aspettati, non credo si tratti di aspecifici.
Veramente non riesco a venirne fuori da questo groviglio!!!
Grazie in anticipo per ulteriori suggerimenti e consigli.. |
stef2 |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2009 : 11:44:52
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Innanzitutto ripeto quello che ti abbiamo detto sia io che Patrizio! Fai un trattamento con DNasi! Nel tuo caso direi che è fondamentale!
Poi:
Citazione:
Due sono all'interno dello stesso esone
se intendi che entrambi i primers sono nello stesso esone (ad. es entrambi nell'esone 2) è normalissimo che da DNA tu ottenga la stessa banda! Se intendi che sono all'interno dell'esone ma in due esoni diversi (ad. es primer F nell'esone 2 e primer R nell'esone 3) da DNA ottieni una banda di PM superiore.
Citazione:
uno non avevo scelta pechè è costituito da un solo esone
anche qua da DNA ottieni la stessa banda!
Citazione:
e gli altri sono tra 2 esoni
se intendi che sono all'interno di esoni... vedi prima
se sono a cavallo di 2 esoni, ad es. primer ha la sequenza iniziale dell'esone 2 e la finale del 3 allora non "dovresti" ottenere prodotto con DNA genomico, anche se è possibile che il primer si appai comunque all'esone 3 sul DNA con una cosa finale che non si appaia, e ottieni amplificato comunque!
Quindi conclusione, fai il trattamento con DNasi e vedi se risolvi i problemi, altrimenti puoi valutare se c'è qualche aspecifico dovuto ad altro! |
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stef2
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 08 giugno 2009 : 09:08:36
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GRAZIE!!!!Tratterò l'RNA con DNasi e poi vi farò sapere!!!
A presto |
stef2 |
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