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maidenmaria
Nuovo Arrivato

ungattinopiccolissimo
Prov.: Trieste


8 Messaggi
Inserito il - 01 luglio 2009 : 11:13:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di maidenmaria Invia a maidenmaria un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sono in crisi! è da mesi che tento di riconoscere tramite western blot la proteina PARP, e ho scoperto che il mio era un problema di concentrazione di lisati proteici.
Così ho effettuato un test su lisato di una linea cellulare diversa per trovare qual era la quantità minima di lisato che dovevo caricare per visualizzare sta maledetta PARP.
Poi ho normalizzato i campioni cellulari (stavolta con una densità di cellule maggiore) in base alla quantità minima dell'altra linea che mi permette di vedere la proteina.

Fin qui in teoria tutto ok, è che in pratica mi ritrovo a dover caricare una quantità di lisato tale che durante la corsa in gel di poliacrilammide al 15% mi sfonda letteralmente i pozzetti da tanto concentrato è...

non so se mi sono spiegata bene..una soluzione potrebbe essere quella di far correre i campioni in un gel meno concentrato (10% o 8%)? Altrimenti????

grazie!
"To strive, to seek, to find and not to yield"

darkene
Utente Junior

occhi



291 Messaggi
Inserito il - 01 luglio 2009 : 11:19:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di darkene Invia a darkene un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io corro 60-80 ug di proteine totali in un gel al 16% e non ho problemi ne di corsa e ne di visualizzazione della PARP. non so che problema hai e sinceramente non ho capito bene che "normalizzazione" hai fatto.
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maidenmaria
Nuovo Arrivato

ungattinopiccolissimo

Prov.: Trieste


8 Messaggi
Inserito il - 01 luglio 2009 : 11:23:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di maidenmaria Invia a maidenmaria un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
con la linea cellulare MDA-MB453 non ho mai avuto problemi. non so qual è la quantità di proteine che carico, mi baso solo sulla densità di cellule che piastro (che a sua volta si basa su precedenti curve di crescita).
Con le linee AU565 ed SKBR3 invece mi risulta impossibile vedere questa proteina (che costitutivamente c'è, e l'anticorpo funziona poichè testato sull'altra linea).
La "normalizzazione" si è basata sulla quantità minima di lisato di MDA-MB453 che mi permette di rilevare la PARP: cerco di avere con le altre due linee cellulari la stessa quantità di proteine, ma nel caricamento risultano essere troppo concentrate...
spero che sia più chiaro...
"To strive, to seek, to find and not to yield"
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