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iacko
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
 Inserito il - 10 febbraio 2008 : 12:38:56
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Ciao a tutti,qualcuno saprebbe dirmi perchè si usa il metanolo nel transfer buffer per elettroblotting??? a me hanno detto che serve a estrarre l'sds dal gel...vorrei saperne qualcosa in più a riguardo....grazie a tutti
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Iacko |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2008 : 13:02:15
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Credo serva per ridurre la tensione superficiale di contatto
tra la membrana di PVDF e le soluzioni tamponate acquose in
cui la membrana viene immersa.
Forse in questo modo le proteine in trasferimento (e gli anticorpi, poi)
non devono superare una "barriera" di tensione superficiale per poter
accedere alla membrana ed attaccarvisi.
Non ne sono certo. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2008 : 17:14:35
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| Il tuo trasferimento ne risente molto |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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orcaimpetuosa
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 11 febbraio 2008 : 02:19:25
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cmq lo vedi, il pvdf sta molto meglio nel metanolo rispetto che nell'acqua, anzi il metanolo serve proprio per attivarlo, no? quindi se c'è transfer buffer funziona sicuramente meglio.
piuttosto, mi dite in che modo interagiscono le proteine col pvdf? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2009 : 16:15:13
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Prima domanda: "il metanolo nel buffer di trasferimento"
- fa dissociare l'SDS dalle proteine (come diceva iaco)
- fa denaturare le proteine ad alto peso molecolare (non quelle a basso peso molecolare) e quindi rende più difficile il trasferimento delle proteine ad alto peso molecolare
- aumenta il legame delle proteine alla membrana
(però si possono benissimo fare buffer di trasferimento senza metanolo, sopratutto per proteine ad alto peso molecolare, l'importante è attivare prima la membrana di PVDF in metanolo)
In sostanza il metanolo nel transfer buffer va benissimo per proteine a basso peso molecolare, per quelle ad alto invece può ridurre il loro trasferimento.
Seconda domanda: "in che modo interagiscono le proteine col PVDF"
sono interazioni idrofobiche, al contrario della Nitrocellulosa che invece stabilisce interazioni elettrostatiche con le proteine.
La membrana di PVDF va prima attivata in metanolo, questo le consente di essere un pochino più idrofilica e di stare in soluzione acquosa, in ogni caso non è che diventa idrofilica come la nitrocellulosa, rimane sempre di natura idrofobica e stabilisce con le proteine legami idrofobici.
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
 Inserito il - 24 ottobre 2009 : 11:35:06
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Leggo solo ora... grazie a un link messo da GFPina, ke il metanolo diminuisce l'efficienza del trasferimento di prot ad alto peso molecolare.
Come potrei sostuirlo nel mio blotting buffer se volessi? |
Ascoltami con gli occhi... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2009 : 19:42:09
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Citazione:
Messaggio inserito da Gst
Come potrei sostuirlo nel mio blotting buffer se volessi?
Eliminandolo!
Se il problema è blottare proteine ad altro peso molecolare, conviene eliminarlo e basta, se invece si parla di sostituzione di qualcosa meno tossico (come nell'altra discussione): etanolo o isopropanolo. |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2009 : 23:34:46
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e perchè tutte le volte che ho dimenticato di mettere
il metanolo nel transfer buffer non sono mai riuscito
a trasferire nulla (né basse né alte al Ponceau)?
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2009 : 11:40:35
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 Eh?! Scusa lo scetticismo GFPina, ma allora dovrei fare il blotting buffer solo con tris glicina e acqua????
Questo vale indipendentemente dal metodo di trasferimento vale il tuo consiglio (semi dry, bagnato...)? |
Ascoltami con gli occhi... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2009 : 16:30:59
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Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos
e perchè tutte le volte che ho dimenticato di mettere
il metanolo nel transfer buffer non sono mai riuscito
a trasferire nulla (né basse né alte al Ponceau)?
Ah beh a me non è mai funzionato il Ponceau in Italia! Solo all'estero.
Comunque il ponceau non è molto sensibile per essere sicuro se hai trasferito o no qualcosa è meglio che colori la membrana con Coomassie, io di solito lo faccio dopo aver finito il WB, ma comunque esistono anche dei metodi per decolorarla se vuoi farlo prima.
Per vedere se è avvenuto il blotting mi baso solo sul marker.
In ogni caso questa è la teoria di come funzionano e a cosa servono SDS e metanolo, poi io praticamente i Blot li ho quasi sempre fatti sia con SDS che con metanolo e non ho mai avuto particolari problemi, ma "personalmente" non mi sono messa a fare esperimenti utilizzando vari Blotting buffer.
Poi se cercate un po' in internet si trova di tutto! C'è chi dice che senza metanolo non gli funziona un tubo, chi dice che lo fa senza metanolo e va benissimo, chi assolutamente è contro l'SDS e chi invece lo usa...
Credo che una volta che uno abbia settato la sua metodica e funziona non valga la pena cambiarla, ma sapere a cosa servono le varie cose per ovviare in caso di problemi è comunque importante.
Io riutilizzavo anche il Buffer di trasferimento 2 volte, visto che comunque ne vanno litrate ogni volta, ma poi altre persone nel lab non erano d'accordo, anche se esistono articoli in proposito:
Transfer Buffer Containing Methanol Can Be Reused Multiple Times in Protein Electrotransfer
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fraarf85
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2009 : 19:32:08
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| Ma veramente il ponceau non è poco sensibile... io utilizzo sia il ponceau che il comassie, sullo stesso gel il risultato è sovrapponibile, anzi io sinceramente preferisco il ponceau perchè secondo me da una colorazione con meno sbafature e poi è veloce! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2009 : 20:02:01
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Citazione:
Messaggio inserito da fraarf85
Ma veramente il ponceau non è poco sensibile... io utilizzo sia il ponceau che il comassie, sullo stesso gel il risultato è sovrapponibile, anzi io sinceramente preferisco il ponceau perchè secondo me da una colorazione con meno sbafature e poi è veloce!
scusa ma questa è veramente la prima volta che la sento! È risaputo che il Ponceau sia meno sensibile del Coomassie!!!
Basta che fai una veloce ricerca in internet per vederlo, comunque giusto per metterne una ti linko questa tabella.
Poi sul fatto che sia più veloce ok, e sul fatto che abbia meno sbavature sinceramente non saprei... io non ho mai avuto sbavature con Coomassie.
Ah dimenticavo "sensibilità" significa che una sostanza più sensibile è in grado di rilevare anche proteine la cui quantità è bassa, quindi se hai tante proteine le vedi bene anche col Ponceau, se sono poche le vedi meglio col Coomassie. Poi dipende anche dal tipo di proteina, non per tutte il legame con il colorante è lo stesso.
Non metto in dubbio che nel tuo caso possa essere benissimo che tu abbia un risultato sovrapponibile, ma non per questo si può dire che il Ponceau sia sensibile al pari del Coomassie.
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Discussione |
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uso del metanolo nel western blotting
Didattica
