| Autore |
Discussione |
|
|
lalery
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
 Inserito il - 04 novembre 2009 : 13:04:12
|
Buongiorno a tutti,
ho un problema: non riesco a sequenziare frammenti sottoclonati, anche se le colonie ci sono e la PCR mi da' la banda che mi aspetto (costrutto+frammento). Quando passo al sequenziamento ottengo sequenze piatte, come se i primers non si attaccassero nemmeno...è a causa del fatto che la porzione genomica d'interesse ha dei palindromi e potrebbe formare delle strutture a forcina? Come posso ovviare a questo problema?
Grazie.
|
|
|
|
|
Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 04 novembre 2009 : 21:54:04
|
Io ho avuto problemi del genere con strutture secondarie,
sei sicura che esistano palindromi consistenti? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
|
 |
|
|
max power
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 04 novembre 2009 : 23:49:34
|
All'atto del sequenziamento le strutture a forcine nn ci dovrebbero essere x via della denaturazione; hai provato a cambiare i primer x il sequenz.?
|
|
|
|
lalery
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2009 : 10:50:31
|
Sì, ho provato a cambiare i primers e confermo la presenza di palindromi....
Perseveriamo, perseveriamo e mi ruscirà prima o poi!
Grazie |
|
|
|
bioecobubble
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2009 : 17:48:02
|
Anche io ho avuto (e ho) a che fare con clonaggi capricciosi
quando mando a sequenziare seleziono la reazione con aggiunta di DMSO che, a quanto mi hanno spiegato, aiuta a distendere il templato.....però a dire il vero almeno un po' di sequenziamento c'era.
Il mancato sequenziamento è capitato quando abbiamo mandato "troppo" templato. Quelli del sequenziamento ci hanno detto che se c'è tanto DNA c'è anche una qntità maggiore di sali derivati dalla purificazione (che inibiscono l'attacco del primer).
Una curiosità....che plasmide stai usando?
|
|
|
|
Soshi Fujiwara
Nuovo Arrivato
60 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2009 : 19:40:51
|
Io non voglio insinuare niente, ma anche io ultimamente ho grandi problemi di sequenziamento, non è che si tratta della stessa azienda sequenziatrice?
Si può nominarla o incorriamo in problemi legali? |
|
|
|
lalery
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2009 : 17:28:12
|
Io uso il Kit TopoTA Cloning (Invitrogen)... settimana prossima ci ritento! Che Dio me la mandi buona!
|
|
|
| |
Discussione |
|
Problemi con sottoclonaggio
Didattica
