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 Inserito il - 24 settembre 2009 : 19:15:58
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ciao!
appena iscritta..
subito una domanda.....
devo trasfettare un plasmide di 3kb e ho difficoltà presumo dovute alla
lunghezza del plasmide. Esiste una correlazione tra tipo di trasfection reagent utilizzato e lunghezza del plasmide??
e qual è la differenza principale tra fugene e fugene hd (roche)?
baci!!
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 24 settembre 2009 : 19:33:06
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Che metodica usi?
Io ho trasfettato un plasmide di 20.70 kb in cellule nervose immortalizzate ND26 mediante liposomi.
Sicuramente a parte la lunghezza del plasmide, ha un ruolo chiave anche la metodica che usi e il tipo di cellule che vuoi trasfettare! |
 
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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11 Messaggi |
Inserito il - 24 settembre 2009 : 21:32:18
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dunque per essere più precisa
devo trasfettare cellule di tumore mammario immortalizzate.
trasfetto e tratto in mezzo senza siero per circa 30ore. le cellule stanno abbastanza bene
utilizzo fugene 3:1
trasfetto in multiwell
500ng di reporter per well.
ho letto che un eccesso di fugene o un eccesso di plasmide potrebbe influenzare negativamente la trasfezione.
potendo fare un numero limitato di prove ho chiesto aiuto...
spero di aver fornito le informazioni che chiedevi
grazie! |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2009 : 17:28:22
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Non trovavo più la discussione!
Comunque, io ho usato il TRANSFAST della Promega e seguito il loro protocollo (http://www.promega.com/tbs/tb260/tb260.pdf). Temo quindi di non poterti essere di grande aiuto!
Ho cercato Fugene ed effettivamente ne esistono 2: il 6 e l'HD.
Non sono riuscito a capire bene le differenze...a me sembrano uguali. Si parla solo di diversi rapporti reagente/DNA.
In ogni caso, sull'inserto dell'HD parla anche di problematiche e possibili cause. Di sicuro avrai già visto, ma te lo linko comunque: https://www.roche-applied-science.com/pack-insert/4709691a.pdf
Ma tu esattamente che problemi hai? Si trasfettano poco o niente? O le cellule muoiono o non crescono dopo la trasfezione?
Di solito uno dei punti limitanti della trasfezione è la purificazione (presenza di contaminanti che non permettono la formazione dei complessi) e la concentrazione del DNA di partenza (se troppo bassa...Ma vedo che tu hai sentito anche di problemi con concentrazioni alte).
La quantità ottimale dipende poi proprio dal tipo di acido nucleico e dalla linea cellulare (e qui purtroppo non saprei che dirti), oltre poi ovviamente da altri fattori come tempo di trasfezione (che potrebbe essere troppo basso) e effetti del siero (che possiamo escludere) e antibiotici (che possono portare alla morte delle cellule). |
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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11 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2009 : 17:50:04
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grazie mille per il tempo che mi hai dedicato...
si in effetti avevo letto le indicazioni del fugene e non avevo riscontrato grandi differenze con il fugene hd.
oggi ho corso il plasmide su un gel d'agarosio....non ho avuto le 3 bande, ma un'unica banda...quindi il dna è linearizzato...
questo influenza il fatto che le cellule stanno bene ma ho valori bassi di luciferasi e TK?? |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2009 : 17:58:21
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Ma hai digerito tu il plasmide prima di farlo correre o era proprio così? Questo ovviamente si fa solo per risalire alla sua concentrazione!
Se hai valori bassi (in che senso? Da un punto di vista qualitativo o quantitativo) del reporter, è segno appunto o che la trasfezione non è andata molto bene, oppure è andata bene ma ci sono problemi nella espressione. |
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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Inserito il - 25 settembre 2009 : 18:21:07
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no! io non ho digerito il plasmide...
me ne hanno dato un'aliquota e l'ho trasformato...pensavo fosse circolare...solo oggi mi è venuto in mente di correrlo...
non credo sia un problema di espressione...credo piuttosto che troppo poco plasmide entra nella cellula....
tempo fa ho utilizzato un plasmide uguale a questo, ma molto più piccolo (che non arrivava a 1000bp; si tratta di un promotore lungo e un promotore corto. quello corto si trasfetta e funziona...quello lungo no....
grazie ancora
:) |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2009 : 19:03:24
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Ma hai una mappa di questo plasmide? Come mai l'hai trovato linearizzato?
Non è che è successo qualcosa e quindi si è effettivamente rovinato...Chissà poi in che punto si è linearizzato (e quindi se intacca promotori vari).
Il fatto che stranamente sia linearizzato mi fa pensare una cosa: di solito si usa linearizzato quando lo si vuole integrare e quindi per una trasfezione stabile.
Tu invece hai parlato di una trasfezione transiente, dove il DNA si perde dopo qualche giorno per normale degradazione (ed un plasmide digerito potrebbe essere soggetto a più facile e rapida degradazione) e diluizione (potrebbe avere problemi di replicazione, non replicandosi con il genoma nucleare e forse quella linearizzata ancora di più)
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La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2009 : 19:05:09
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Citazione:
Messaggio inserito da Luis 22
Non trovavo più la discussione!
Spostata perché non c'entrava nella sezione off topic!
Se guardi nelle "discussioni recenti" dovresti trovarle comunque le discussioni.
Comunque alcuni tipi di agenti transfettanti funzionano meglio in alcume cellule o con alcuni plasmidi e altri con altri, non esiste una regola fissa, sarebbe da provare. |
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11 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2009 : 19:16:57
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non mi aspettavo di trovare un plasmide linearizzato....
non ho niente di questo plasmide..perchè me l ha fornito un altro team...mi rivolgo a loro...
cmq ti farò sapere come va a finire...
mi sono fatta un'idea che il problema non sia il tipo di reagente trasfettante usato...ma qualcosa relativa al plasmide...come hai intuito...
grazie mille....
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2009 : 19:21:38
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Prego, è stato un piacere!
Comunque davvero poi scrivi qua come va a finire! A questo punto sono molto curioso! |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2009 : 19:23:22
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Avevo cercato anche nel mio profilo a ultimi messaggi da me inseriti, ma non mi dava niente prima! Boh!
EDIT: anzi, continuo a non vederla tra i miei ultimi messaggi...
Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Citazione:
Messaggio inserito da Luis 22
Non trovavo più la discussione!
Spostata perché non c'entrava nella sezione off topic!
Se guardi nelle "discussioni recenti" dovresti trovarle comunque le discussioni.
Comunque alcuni tipi di agenti transfettanti funzionano meglio in alcume cellule o con alcuni plasmidi e altri con altri, non esiste una regola fissa, sarebbe da provare.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2009 : 19:38:33
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@ Luis: strano dove non la vedi esattamente?
Dal tuo profilo se clicchi su: "Contenuti inseriti"
che per il tuo profilo è questa pagina: http://www.molecularlab.it/forum/profilo.asp?id=355&page=content
non lo vedi perché ci sono solo le ultime discussioni "aperte" da te, non quelle a cui hai partecipato.
Se da lì clicchi su: "tutti i messaggi" ti compare questa pagina:
http://www.molecularlab.it/forum/search.asp?mode=DoIt&MEMBER_ID=355
con tutte le discussioni a cui hai preso parte e lì la trovi.
@ check1: visto che mi sono intromessa in questa discussione in cui comunque Luis 22 ti ha dato delle ottime risposte, io avevo risposto solo alla prima tua domanda ovvero:
Citazione:
Esiste una correlazione tra tipo di trasfection reagent utilizzato e lunghezza del plasmide??
Comunque sono dell'idea anch'io che la cosa migliore sia rivolgersi a che te l'ha dato, anzi magari lo hanno transfettato e sanno darti dei consigli per il caso specifico.
EDIT: noto adesso, Luis congratulazioni per la promozione a 2 stellette!!!  |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2009 : 20:27:47
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Si ho notato! In effeti mi aveva tratto in inganno quel "ultimi messaggi" (e non discussioni).
Comunque, grazie per gli "auguri"! Ne sono passati di giorni da quel 13 febbraio 2005, data di iscrizione!
Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
@ Luis: strano dove non la vedi esattamente?
Dal tuo profilo se clicchi su: "Contenuti inseriti"
che per il tuo profilo è questa pagina: http://www.molecularlab.it/forum/profilo.asp?id=355&page=content
non lo vedi perché ci sono solo le ultime discussioni "aperte" da te, non quelle a cui hai partecipato.
Se da lì clicchi su: "tutti i messaggi" ti compare questa pagina:
http://www.molecularlab.it/forum/search.asp?mode=DoIt&MEMBER_ID=355
con tutte le discussioni a cui hai preso parte e lì la trovi.
@ check1: visto che mi sono intromessa in questa discussione in cui comunque Luis 22 ti ha dato delle ottime risposte, io avevo risposto solo alla prima tua domanda ovvero:
Citazione:
Esiste una correlazione tra tipo di trasfection reagent utilizzato e lunghezza del plasmide??
Comunque sono dell'idea anch'io che la cosa migliore sia rivolgersi a che te l'ha dato, anzi magari lo hanno transfettato e sanno darti dei consigli per il caso specifico.
EDIT: noto adesso, Luis congratulazioni per la promozione a 2 stellette!!!
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Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2009 : 20:33:23
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hahahahaha!!!!
ho fatto casino appena entrata...
ho letto le vostre discussioni...
certo che ti farò sapere....
appena faranno sapere a me!!...
presserò parecchio...ma credo che ci vorrà la prox settimana...
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Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2009 : 18:00:03
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pensavate che mi fossi dimenticata....
...
ancora nessuna novità sul mio tormentato plasmide linearizzato....
speriamo in settimana
a presto
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2009 : 10:13:06
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Ok aspettiamo notizie allora!
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2009 : 20:27:31
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Stavo proprio cercando questa discussione, perchè non mi sono certo dimenticato!
Restiamo in attesa! |
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Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2009 : 20:49:22
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ciaoo!!!
finalmente mi hanno riportato il mio plasmide !!!
e finalmente sono riuscita a trasfettarlo
e ad avere una bella transattivazione...
:-)
mi ci è voluto un mese....ma il risultato è quello che conta...
il plasmide precedente era rovinato evidentemente.
per migliorare l efficienza della trasfezione,
ho trasfettato poco dopo aver piastrato le cellule...
grazie ancora del vostro interessamento
e a prestooo!!!!!!!! |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2009 : 00:48:14
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| Evviva! Sono felice per te!!! |
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Trasfezioni transienti
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