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jeje
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
 Inserito il - 17 novembre 2009 : 18:22:13
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ciao a tutti avrei bisogno di un consiglio, sto facedo dei western blot su una proteina fosforilata...ecco, il punto è che dovrei fare anche la proteina totale.. mi sono accorta facendo lo stripping che non funziona benissimo, nel senso che rimane del primario..è corrett farlo comunque?magari il mio ragionamento è sbagliato ma io ho pensato che se in seguito allo stripping incubo con l'ab anti proteina totale questa si lega in un sito diverso da quello del ab anti fosfo..e quindi non dovrebbero competere..il dubbio è se il segnale del totale copra o meno il segnale del fosforilato (rimandendo del primario si leghera del secondario)....
potrei caricari i miei campioni in doppi (uno per il fosfo e uno per il tot) ma mi hanno detto che l'errore è enorme (trasferimento e pipettata) non so se mi sono spiegata ben..:) voi cosa mi consigliate? grazie!!!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2009 : 18:37:04
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Io caricherei in doppio, normalizzando rispetto alla stessa proteina. In questo modo gli errori di pipettata etc. verranno eliminati dalla normalizzazione.
Poi ad ogni modo tu vuoi vedere i livelli relativi, non assoluti, quindi farlo su due membrane non ti darà alcun problema. |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2009 : 19:26:54
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Sto facendo la stessa identica cosa di questi giorni e
ti confermo che utilizzando il mio protocollo di stripping
è possibile rendere il segnale del primario residuo
sufficientemente basso da non sovrapporsi al corrispondente
fosfo, o totale, o comunque ad una banda alla stessa altezza.
In pratica devi potenziare l'incubazione con il primario che
usi post-stripping, in modo che il suo segnale compaia molto
preococemente durante l'esposizione ECL (tipo a 30 sec)
mentre il segnale residuo del primario pre-stripping
dovrebbe comparire tardivamente nell'esposizione.
Non so che protocollo usi per strippare, ma per provare
a vedere a quale timepoint dell'esposizione salta fuori
il segnale del primario residuo, puoi provare a incubare
la membrana neostrippata con il corrispondente secondario
(quello che hai usato prima di stripparla) e settare
le condizioni in modo da prevedere il momento esatto.
Ovviamente è un compromesso.
La sicurezza assoluta? ce l'hai solo se uno dei due primari
è mouse e l'altro è rabbit :)
Puoi comunque fare su diverse membrane, come dici tu,
e normalizzare tranquillamente sulla stessa proteina
come ti ha suggerito chick. Solo così fai il doppio del lavoro.
Valuta tu
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2009 : 19:28:26
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Se ti serve, questo è il mio protocollo di stripping:
- Subgmerge membrane with:
62.5 mM Tris-HCl pH 6.8
1 % SDS
50 mM beta-mercaptoethanol
- Let rocking for 30' at 60°C
- Wash 3x with PBST
- Re-saturate filter with milk or BSA
Non è molto potente, mi permette di strippare due
volte di seguito senza perdere troppo materiale
(carico 50 ug di proteina) per cui lascia un po'
di primario residuo, ma solo se l'incubazione
con questo è stata estremamente protratta (tipo O/N).
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2009 : 19:31:33
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| absolutely |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2009 : 19:52:12
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Comunque la normalizzazione sull'actina (o comunque su un hk) va SEMPRE fatta.
mmmm non sono d'accordissimo! La normalizzazione con un HK va fatta se vuoi vedere se l'espressione delle tua proteina varia nei vari campioni. Se invece stai analizzando una situazione in cui ti interessa sapere solo quanto la proteina viene fosforilata non ce n'è bisogno perchè comunque fai un rapporto: fosforilata/totale.
E' già normalizzato di per sé! D'altronde se anche lo facessi otterresti lo stesso identico risultato.
Caso diverso è se analizzi due membrane diverse, allora in questo caso avrebbe senso per assicurarti di aver caricato la stessa quantità su entrambe. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2009 : 00:23:40
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Utente GFPina, non sono completamente d'accordo! (ghgh :D)
Ad esempio, nel mio caso, stavo cercando di quantificare
il cambiamento della quota fosforilata rispetto alla quota
non fosforilata ma - caso di serendipità - mi sono accorto
che anziché cambiare la quota fosforilata...quello che
cambiava tra i vari campioni era la quota non fosforilata!!
Se non avessi prima normalizzato la non fosforilata sul
controllo interno (housekeeping o no che sia) prima di
normalizzare la fosforilata sulla non fosforilata, non
mi sarei mai accorto di questo cambiamento, perchè pare che
nelle mie celluline il rapporto fosfo-non fosfo rimanga costante!
Quindi secondo me è un controllo che va sempre fatto, a priori,
perchè comunque - anche se vuoi solamente sapere quanto una
proteina viene fosforilata - avrai sempre un pozzetto di controllo
a cui paragonarla, e dovrai essere sicuro che nel tuo controllo la
quota non fosforilata sia quantitativamente uguale, cosa (pare)c
che non è sempre vera....
(spero di non aver fatto casino  ) |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2009 : 11:23:14
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Mmmmmmmmm forse non mi sono spiegata bene!
Innanzitutto, leggendo il tuo post questa affermazione:
Citazione:
Ad esempio, nel mio caso, stavo cercando di quantificare
il cambiamento della quota fosforilata rispetto alla quota
non fosforilata
in genere è la quota di fosforilata rispetto al totale (fosforilata + non fosforilata) anche perchè in genere gli anticorpi riconoscono la proteina totale è difficile avere un anticorpo che riconosca solo la forma non fosforilata.
Se il tuo caso è veramente fosfo rispetto a non fosfo (se veramente hai un Ab che la riconosce) la cosa può essere un po' diversa.
Detto questo, come dicevo nel post precedente un conto è valutare se la tua proteina varia nei diversi campioni, quindi la normalizzi rispetto ad un HK.
Ad es. la proteina A nei campioni 1, 2 e 3 avrai:
A1/HK1 A2/HK2 A3/HK3
Se vai a vedere il rapporto della proteina A fosforilata rispetto alla proteina A totale, sarebbe:
A1-P/A1 A2-P/A2 A3-P/A3
se normalizzi rispetto ad un HK (ammesso che tu abbia tutto sulla stessa membrana e possa escludere differenze nei campioni dovute ad es. a errori di pipettamento) ottieni questi rapporti normalizzati:
(A1-P/HK1)/(A1/HK1) ecc...
siccome HK1 è uguale, è esattamente la stessa banda!
Avrai: (A1-P/HK1)/(A1/HK1) = A1-P/A1
Quindi se vuoi puoi farlo benissimo, ma fai un conto inutile.
Questo intendevo quando dicevo:
Citazione:
... comunque fai un rapporto: fosforilata/totale.
E' già normalizzato di per sé!
Spero sia chiaro ora!  |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2009 : 14:39:52
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Ho capito cosa intendi, è verissimo, ma io dicevo solo
che se ci si limita soltanto a normalizzare la fosforilata
sulla totale (o sulla non fosforilata come nel mio caso)
si potrebbe perdere informazione qualora la ratio si
mantenesse costante al ridursi della rappresentazione
totale di quella proteina.
Cioè secondo me è importante fare questo calcolo:
(A1-P/A1)/(A1/HK1)
Nel numeratore c'è il termine che - come dici tu -
normalizza i due termini senza bisogno di housekeepings.
Al denominatore, però, ci aggiungi la rappresentazione
relativa della proteina totale rispetto agli altri campioni,
così non perdi in nessun caso informazione.
N.B.
Nel mio caso è ancora più incasinata la situazione,
perchè il mio Ab riconosce "preferentially non
phosphorylated protein" quindi sommando le due
bande (P e un-P) dovrei avere una stima del totale,
ma devo ancora un po' scervellarmi sui dati che ho
prima di poter dire una cosa simile... |
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