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Stella86
Nuovo Arrivato
42 Messaggi |
 Inserito il - 19 febbraio 2010 : 16:35:33
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Scusate ragazzi...il mio professore vuole sapere come posso produrre una proteina a partire da un mRNA...
Secondo il mio ragionamento..prendo l'mRNA e tramite trascrittasi inversa mi PRODUCO il cDNA ..dopo effettuo una PCR e, una volta ottenuta una grande quantita' di cloni con PCR ,taglio il mio segmento con enzima di restrizione . Quando la cellula assume il costrutto cn inserto, all'interno della stessa, avvengono i processi di trascrizione e traduzione.
Infine seguito di quest'ultima otteniamo la proteina di nostro interesse..
ORA..la mia domanda è questa..Ma dopo la PCR devo direttamente tagliare con e.di restrizione o devo fare altro??
GRAZIE MILLE IN ANTICIPO,SPERANDO VIVAMENTE IN UNA VOSTRA RISPOSTA!
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Stella86
Nuovo Arrivato
42 Messaggi |
 Inserito il - 20 febbraio 2010 : 17:40:16
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semplifico la cosa ...dato un mRNA tramite trascrittasi inversa ottenco il cDNA..ora non so' se tagliarlo con enzimi di restrizione o effettuare la PCR subito.
Aiutatemi sono in crisi  |
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Stella86
Nuovo Arrivato
42 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2010 : 17:50:10
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| ..volevo dire ottengo il cDNA ...SORRY friends.. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2010 : 01:30:02
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Amplifichi mediante PCR altrimenti non hai "solo" il cDNA X che ti interessa ma una miscela (non sto a dilungarmi sul fatto che il cDNA senza PCR è a singolo filamento o un ibrido DNA/RNA, ma ci sarebbe anche quello da considerare), isoli il tuo cDNA amplificato (in genere dopo la PCR si purifica l'amplificato) e poi lo tagli con gli enzimi di restrizione.
Beh il tuo dubbio era solo questo però tieni presente che nel tuo discorso iniziale mancano dei bai pezzi:
Citazione:
Messaggio inserito da Stella86
...taglio il mio segmento con enzima di restrizione . Quando la cellula assume il costrutto cn inserto, all'interno della stessa, avvengono i processi di trascrizione e traduzione.
Infine seguito di quest'ultima otteniamo la proteina di nostro interesse..
dopo averlo tagliato devi "inserirlo" all'interno di un vettore (tagliato con gli stessi enzimi), la cosa importante è che sia un "vettore di espressione", cioè deve avere tutte le sequenze che consentano alla cellula di trascrivere e tradurre il cDNA inserito.
Poi trasformi una cellula (eucariote, procariote... dipende dai casi) e questa produrrà la proteina (se tutto va bene, la pratica è un po' diversa dalla teoria  ), dopo di che purifichi la tua proteina.
Questo per mettere i punti principali, nella pratica ci sono altri steps in mezzo, ma le cose fondamentali che ti serve sapere sono queste.
P.S. se ti accorgi di aver fatto un errore di battitura nel tuo messaggio non c'è bisogno che ne scrivi uno nuovo, basta che usi il tastino "modifica messaggio"  che trovi sopra al tuo messaggio per correggerlo. |
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xgabrix
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2010 : 13:44:26
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| Ciao a tutti..non sono qui per rispondere alla domanda..ma volevo chiedere, dato che io sono al primo anno in scienze biologiche, se potevo fare questo tipo di esperienze in laboratorio chiedendo da qualche parte o se devo aspettare i prossimi anni per seguire poi i laoratori all'università...perchè sono cose molto interessanti che vorrei conoscere e approfondire fin da subito-..... GRAZIE IN ANTICIPO.. :D |
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kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2010 : 15:47:38
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| la domanda è troppo generale, perchè in realtà ci sono dei kit che ti permettono di ottenere la proteina direttamente dal rna IN VITRO e senza colture cellulari/batteriche... in coltura invece, secondo me, non c'è bisogno di una trasfezione stabile eucariotica (ma dipende dalla proteina ovviamente!!).. ma basta un plasmide... |
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produzione di una proteina
Didattica
