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giuli_v
Nuovo Arrivato
Città: Pavia
7 Messaggi |
 Inserito il - 21 febbraio 2010 : 18:32:01
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Ciao a tutti,
volevo sapere come si utilizza la reverse transcriptase PCR per capire se una sequenza contiene un gene o no.allora estraggo l'RNA, faccio il cDNA, lo amplifico con una normale PCR, elettroforesi su gel.....e poi????
grazie mille!
ciao ciao
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2010 : 19:37:37
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hmmmmm.....
non capisco la tua domanda.
Se stai retrotrascrivendo dell'mRNA sai già che contiene un gene...
Forse la domanda è: come usare la RT-PCR per vedere se un gene è espresso? |
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giuli_v
Nuovo Arrivato
Città: Pavia
7 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2010 : 19:47:37
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si vorrei capire per cosa si usa la RT-PCR, perche sulle slide della prof c'è scritto che serve per sapere se in una sequenza c'è un gene..ma se ho l'mrna è ovvio che il gene c'è!
alla rt-pcr segue qualche altra tecnica o hai solo il tuo cDNA amplificato? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2010 : 20:16:29
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Guarda, io la RT-PCR l'ho sempre usata nel caso in cui si cerca di capire se un certo gene X è espresso.
Estrai tutto l'mRNA, lo retrotrascrivi tutto a cDNA e poi fai una PCR per il gene X. Se il gene X era espresso avrai un suo cDNA e quindi una banda sul gel, altrimenti non avrai la banda.
Ci sono anche altri utilizzi, ma sinceramente "capire se in una sequenza c'è un gene"...non mi torna, ma non sono un esperto di biologia molecolare. |
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Soshi Fujiwara
Nuovo Arrivato
60 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2010 : 20:28:57
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In teoria quello che retrotrascrivi sono tutti geni!
Se per retrotrascrivere usi un poli-d(T) del tipo
5'-TTTTTTTTTTTTTTTVN-3'-OH
allora puoi stare tranquillo che tutto ciò che hai retrotrascritto è espresso e che sicuramente è un gene (e a maggior ragione così puoi escludere miRNA o altri RNA non codificanti).
La cosa è ancora più vera se usi un primer specifico per un gene.
Io cmq ho utilizzato la RT-PCR in questi casi:
- per verificare la presenza di un trascritto
- fare delle quantificazioni di trascrittomica molto blande su gel
Spero di essere stato d'aiuto. |
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giuli_v
Nuovo Arrivato
Città: Pavia
7 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2010 : 21:07:29
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Grazie a tutti e due.siete stati gentilissimi  ciao! |
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 24 febbraio 2010 : 15:40:22
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Citazione:
Messaggio inserito da giuli_v
si vorrei capire per cosa si usa la RT-PCR, perche sulle slide della prof c'è scritto che serve per sapere se in una sequenza c'è un gene..ma se ho l'mrna è ovvio che il gene c'è!
alla rt-pcr segue qualche altra tecnica o hai solo il tuo cDNA amplificato?
beh, l'RT-PCR tecnicamente consiste in due reazioni diverse.. con la prima (RT) retrotrascrivi il tuo mRNA (che dovrebbe essere tutto quello presente nel tuo campione - tessuto, cellule...) in cDNA, dopodichè fai una PCR con dei primers specifici per verificare l'espressione del gene, però in genere per espressione si intende 'livelli di espressione' più che 'presenza'. se il gene non c'è, cioè non è espresso, dopo la corsa sul gel d'agarosio non vedi niente, altrimenti vedrai bande di diversa intensità a seconda di quanto viene espresso il gene nei tuoi campioni.
quindi direi che più che verificare la presenza del gene in una particolare sequenza, l'RT-PCR si usa per verificarne la presenza in un dato campione, infatti può capitare che il gene sia mutato, silenziato etc., per cui non viene espresso, però tendenzialmente quando fai la PCR presumi che il tuo gene ci dovrebbe essere, e dovresti sapere anche dove localizza.. |
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Discussione |
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RT-PCR
Didattica
