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Discussione |
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mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
 Inserito il - 19 aprile 2010 : 13:55:45
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Domandina..se io ho questa sequenza
TAGTTTTAGAC TGTCAGAAGTGCGAAAGCAA CGTGTTTCATTTAAATAGCAGACAGTTTA
Il mio primer reverse sta nella parte staccata (TGTCAGAAGTGCGAAAGCAA) e voglio aggiungere bamh1 piu codina gcg..quindi la sequenza 5’-3’ sara
CGCggatccTTGCTTTCGCACTTCTGACA3
Giusto?
mentre un eventuale foward sara gcgGGATCC TGTCAGAAGTGCGAAAGCAA
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2010 : 15:38:29
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si, ma se è un reverse il sito di restrizione deve stare al 3', non al 5'.
quello del fw è giusto! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2010 : 16:01:46
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Citazione:
Messaggio inserito da darkene
si, ma se è un reverse il sito di restrizione deve stare al 3', non al 5'.
perchè al 3'?
Se metti qualcosa al 3' il primer non si attacca più alla sequenza bersaglio! Le code si mettono "esterne" quindi sempre in 5'!
Comunque mo-lab, non ho capito bene cosa dovresti fare, devi mettere il sito di restrizione e la codina gcg ad entrambi i lati dell'amplificato? Cioè:
GCG-BamHI-AMPLIFICATO-BamHI-GCG |
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mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2010 : 16:11:48
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| no..devo fare primer reverse bamh1 gcg..questo sarebbe 3'-5'..poi per ordinare il 5'-3- devo fare reverse complement no? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2010 : 16:24:32
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Ah ok! Era "l'eventuale forward" che mi lasciava perplessa.
Comunque è giusto come l'hai segnato!
Questa è la sequenza con attaccato il primer:
TAGTTTTAGAC TGTCAGAAGTGCGAAAGCAA CGTGTTTCATTTAAATAGCAGACAGTTTA
3'-ACAGTCTTCACGCTTTCGTTCCTAGGCGC-5'
per ordinarlo non fai altro che scriverlo da 5' a 3', quindi al contrario, reverse (non complement), come l'ha scritto tu:
5'-CGC-GGATCC-TTGCTTTCGCACTTCTGACA-3' |
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Morfeo
Nuovo Arrivato
Città: Roma
110 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2010 : 16:25:47
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Un primer reverse è fatto così:
5'-------------------------------------------------3' STAMPO
3'------------------5' reverse primer con sito di restrizione |
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Morfeo
Nuovo Arrivato
Città: Roma
110 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2010 : 16:27:00
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| Scusate ma è venuto male il disegno qua, immaginatevelo appaiato all'estremità 3' dello stampo con una parte che esce che sarebbe il sito di restrizione. |
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mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2010 : 18:21:17
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| ies!! thank you! |
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Primers reverse clonaggio
Didattica
