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Iaia_pg
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16 Messaggi |
 Inserito il - 07 maggio 2010 : 11:53:51
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Ciao a tutti!
Ho un problema con un esercizio...non so neanche da che parte iniziare; mi potreste aiutare?
Il testo è il seguente:
Si vuole digerire un DNA plasmidico con 2 coppie di enzimi di restrizione [(EcoR I/Hind III) e (EcoR I/Sma I)].
Le condizioni di azione di questi 3 enzimi sono:
- EcoR I (5U/microL in 50% di glicerolo): agisce in tampone composto da Tris 0,1 M pH = 7,6; NaCl 50 mM, MgCl2 10mM e a una temperatura ottimale di 37° C.
- Hind III (5U/microL in 50% di glicerolo): agisce in tampone composto da Tris 0,1 M pH = 7,6; NaCl 50 mM, MgCl2 10mM e a una temperatura ottimale di 37° C.
- Sma I (5U/microL in 50% di glicerolo): agisce in tampone composto da Tris 0,1 M pH = 9,4; NaCl 150 mM, MgCl2 25 mM e a una temperatura ottimale di 60° C.
Sapendo che:
- si vogliono digerire 10 microg di DNA plasmidico di cui si possiede una soluzione a 0,5 microg/microL
- una unità (U) di enzima digerisce 1 microg di DNA in 1 h alla temperatura ottimale dell'enzima.
Per essere certi che il taglio sarà totale si usa un eccesso di enzima di 5 volte.
Disponete di due soluzioni di tampone di digestione concentrate:
SOLUZIONE 1: Tris 1 M, pH = 7,5; NaCl 0,5 M; MgCl2 0,1 M
SOLUZIONE 2: Tris 1 M, pH = 9,4; NaCl 1,5 M; MgCl2 0,25 M
Affinché gli enzimi funzionino correttamente, la concentrazione in glicerolo non deve superare il 5% del volume reazionale totale.
Dare:
- le condizioni di reazione per il taglio di EcoR I/Hind III ( protocollo sperimentale; volume dei differenti componenti e temperatura d' azione)
- le condizioni di reazione per il taglio di EcoR I/Sma I ( protocollo sperimentale; volume dei differenti componenti e temperatura d' azione).
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 07 maggio 2010 : 12:30:16
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Prova a ragionarci un pò su... cosa devi fare per prima cosa? io direi intanto di partire con il calcolo di quanto devi diluire le varie soluzioni e di conseguenza i volumi che devi aggiungere per ogni soluzione/reagente. Lo stesso devi fare per il DNA, quanto volume devi prendere dalla tua soluzione 0.5 ug/ul per avere 10ug totali? Per quanto riguarda l'enzima, ne devi prendere una quantità 5 volte in eccesso rispetto alla quantità di DNA... Tieni presente che l'enzima è in glicerolo al 50% e che la concentrazione di questo nella reazione finale deve essere inferiore al 5% (in pratica il volume di enzima che prendi deve essere inferiore al 10% del volume totale di reazione).
Dai che nn è così difficile, ragionaci ;) |
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Iaia_pg
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 08 maggio 2010 : 11:24:51
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Mmmmmm....ok, cercherò di spremere le meningi più che posso  !!! |
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Iaia_pg
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 08 maggio 2010 : 21:46:16
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Ho provato a fare l'esercizio ma sono riuscita a risolvere solo la prima parte (sempre se è giusta!!!), quindi il protocollo per la prima coppia di enzimi. La seconda proprio non so come farla visto che i due enzimi agiscono in "condizioni" diverse. Mi potete aiutare?? Proprio non ci arrivo   !!
Potreste anche vedermi se la parte che ho fatto è corretta?
1)Devo prelevare 10 microg di DNA plasmidico che corrispondono a x microL di soluzione:
o,5 microg DNA : 1 microL soluzione = 10 microg DNA : x microL
=> x = 20 microL
2)Per digerire 10 microg di DNA dovrei prelevare 10 U di enzima che corrispondono a 2 microL di soluzione; in realtà l'enzima deve essere in eccesso(5X), quindi il volume di soluzione da prelevare è 10 microL.
3)Il tampone di digestione di partenza è 10 volte più concentrato rispetto a quello di cui ho bisogno =>devo diluire. Se suppongo di voler ottenere un volume totale della soluzione uguale a 100 microL allora dovrò prelevare 10 microL di soluzione tampone
4)Finora la mia soluzione ha un volume di 40 microL, quindi aggiungo 60 microL di H2O per arrivare a 100 microL.
Scusate se mi sono dilungata un po' ma volevo essere certa di aver ragionato bene!! |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2010 : 11:51:17
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Il ragionamento in linea teorica è esatto. 20 sono i microlitri di DNA da prendere. 10ul per enzima perchè si vuole usare un eccesso (a me però sembra uno spreco tutto sto enzima, sarà perchè lavoro su volumi minori  ).
Siccome hai che EcoRI e Hind III hanno il loro optimum di attività alla stessa temperatura e con lo stesso buffer, puoi pensare anche di fare una doppia digestione in contemporanea, cioè usando i due enzimi insieme.
Quindi nel tuo tubo di reazione metterai:
20 ul DNA ---> corrispondenti a 10 ug
10 ul EcoRI
10 ul HindIII
E poi? siccome sai che l'enzima si porta appresso il glicerolo (è in una sol.ne stock al 50% in glicerolo) e che la quantità di glicerolo nella sol.ne finale dev'essere inferiore al 5% (cioè diluito più di dieci volte) di conseguenza dovrai diluire i tuoi enzimi in modo che il loro volume iniziale sia <10% del volume totale di reazione. Siccome qui hai due enzimi, con un volume iniziale di 20 ul (ovviamente conti entrambi gli enzimi) puoi pensare di eseguire la tua reazione in un volume finale di 300 ul (20/300= circa 6,6%).
Ergo la reazione sarà:
20 ul DNA ---> corrispondenti a 10 ug
10 ul EcoRI
10 ul HindIII
30 ul di Buffer 10X
H2O to 300 ul (cioè aggiungi 230 ul H2O).
E mantieni il tuo tubicino a 37 °C (per esempio a bagno maria) per un'ora.
Nella pratica si usa anche allungare il tempo a 2-3 ore di digestione (a volte si fa anche Over Night) e magari risparmiare un pò di enzima senza usarne troppo in eccesso.
Per la seconda reazione, beh chiaramente non puoi usare tutti e due gli enzimi contemporaneamente (perchè lavorano in condizioni diverse)... quindi? Ti viene in mente qualcosa?
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Iaia_pg
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2010 : 21:24:17
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Mmmmm....vediamo, per prima cosa digerisco il DNA con EcoRI preparando una soluzione che presenta condizioni di azione ottimali per EcoRI; poi recupero il DNA digerito e lo introduco in una nuova soluzione preparata rispettando le condizioni ottimali di azione per SmaI; quindi lascio agire questo enzima.
Ti prego dimmi che é giusto  |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2010 : 22:17:04
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| sì |
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Iaia_pg
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 10 maggio 2010 : 16:32:48
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Grazie per l'aiuto!!! |
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