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19 Messaggi |
 Inserito il - 31 maggio 2010 : 10:40:44
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Salve,
sto facendo una long PCR su DNA genomico per ottenere due frammenti: uno di circa 16000 e l'altro circa 6000bp. Invece di questi ottengo però due altri frammenti di 3000 bp e 2400bp con una resa molto elevata e non c'è traccia di quelli di mio interesse...ho provato ad alzare di un grado la temperatura di annealing, ma ottengo lo stesso pattern...potete darmi qualche consiglio?
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 31 maggio 2010 : 15:38:43
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16 kb è difficile ma non impossibile, la 6 kb molto più realistica.
Ci sarebbero una serie di cose da verificare prima di imbarcarsi in cose complicate.
1. Verifica che i primers non si annilino a nient'altro, basta un Blast su genomico e su mRNA
2. Verifica la temperatura dei primers con diversi programmi, non devono avere una differenza di Tm tra di loro maggiore di 1,5-2°C. Devono avere una %GC compresa tra 40 e 60% e non devono essere troppo diversi tra di loro in termini di lunghezza. Non devono appaiarsi tra di loro e bla bla bla.
3. Verifica con delle PCR più piccole, es di 1000-2000 bp che il tuo tratto di DNA c'è e c'è tutto, al limite potresti farne diversi pezzi e poi metterli insieme successivamente.
4. Verifica che nel tratto che vuoi amplificare ci sia una %GC che sia inferiore al 60%, altrimenti dovresti considerare l'uso di buffer diversi, con DMSO, formammide o roba simile.
5. Prova anche con altre coppie di primers: mutazioni, polimorfismi e situazioni strane possono rendere una specifica coppia di primers inutili
6. Immagino tu stia usando una Taq adatta, tipo quella della Roche, Clontech e simili che sono garantite anche a >20.000 bp. Dovresti provare prima tutti i buffers che ti consigliano, poi modificare un po' le condizioni. Es usare DMSO, dNTP a concentrazioni maggiori, più o meno DNA stampo etc.
7. Verifica anche la qualità del tuo templato, se viene da genomico allora verifica che sia integro (su gel), puro con spettrofotometro o meglio al nanodrop. Se viene dall'RT è meglio usare un'altra strategia
8. Verifica i tempi di amplificazione, circa 1 min/kb ma se ci sono zone ricche di GC meglio 2 min/kb. Non esagerare con i cicli, altrimenti la taq si inattiva prima della fine.
9. Verifica che l'amplificato non sia una parte del gene di tuo interesse, basta fare una nested del tuo prodotto di PCR, tipo 1/10 del tubino lo usi per un'altra PCR con primers più interni.
Dopo tutte queste verifiche si può discutere di problemi da affrontare.
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