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sussurri84
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3 Messaggi |
 Inserito il - 16 agosto 2010 : 16:25:59
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Ammetto che il titolo non sia chiarissimo, ma ci vorrebbe molto piú spazio per spiegare il problema.
Allora: sto disperatamente cercando di ottenere un costrutto contenente un gene modificato di A. fumigatus. Il gene in questione é di 9 kb.
Partendo da PCR classica per amplificare il gene, ho disegnato i primers e sembrano andare bene, ho usato la Phusion Taq, e il frammento amplificat sembra specifico e della dimensione corretta. L´ho quindi clonato nel vettore pCR2.1 seguendo il protocollo, ho trasfosmato delle cellule competenti di coli e ho isolato le colonie recanti il costrutto nel plasmide con IPTG-XGal. Non serve continuare oltre la descriione, per arrivare al completo fallimento, perché già da un controllo effettuato a questo punto con EcoRI sul plasmide estratto dalle colonie si notano dei problemi. Non sistono in nessun campione le bande che aspettavo dalla digestione.
Da notare che questo procedimento é stato ripetuto minimo una decina di volte, sempre con risultati scorretti.
Ho quindi provato a cambiare strategia, e ad usare la cosiddetta 3-fragment PCR. Anche in questo caso, da una prima PCR con nuovi primers da me disegnati e piú volte ricontrollati ottengo i 3 frammenti desiderati. Quando li mescolo in una nuova mix per PCR, il risultato é decisamente pieno di aspecifici. Variare la temperatura non é servito, aumentare i tempi di annealing o estensione nemmeno. Ho comunque purificato da gel la banda corrispondente al costrutto finale, e vista la bassa concentrazione ho deciso di fare un`altra PCR, solo per amplificare il costrutto. Da questa PCR, sono ricomparsi gli aspecifici. Non so davvero cosa possano essere quelle bande, non hanno delle dimensioni corrispondenti a qualcosa che metto nella mix, e ricompaiono anche dopo purificazione!
Non so davvero piú che strategie tentare.
Avete qualche consiglio?
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Pella86
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30 Messaggi |
Inserito il - 18 agosto 2010 : 16:57:00
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per le bande non specifiche non so cosa dirti, ormai penso che devi cambiare i primer. Anche se mi sembra strano che ti escano ancora dopo la purificazione.
tienila come ultima chance, nel caso puoi usare la ricombinazione omologa nel lievito per costruire il plasmide. |
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sussurri84
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 19 agosto 2010 : 14:45:04
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| giá ordinati i primer per tentare la gateway strategy. Ma sono abbastanza terrorizzata all`idea che se anche questo fallisce, non so proprio piú che fare |
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Clonaggio: se non si riesce a ottenere il costrutto
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