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Autore Discussione  

Gst
Utente Junior


Prov.: Roma
Città: Ariccia


143 Messaggi
Inserito il - 27 agosto 2010 : 18:35:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gst Invia a Gst un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti... ho un problemino con una pcr che non riesco a mettere a punto!

I miei primers sono:
For 5'-atg gtg agc aag ggc gag gag ctg-3'
Rev 5'-tta ctt gta cag ctc gtc cat gcc-3'

ho provato con annealing 58C per 45''
e poiho prvato cn annealing 65C per 30'' (perche in lab mi e stato detto ke molto tempo fa questi primers si usavano a questa temperatura... anche se poi sono stati abbandonati perche non davano troppa soddisfazione).


A me servono per genotipiz una linea di topi ke non usiamo molto,quindi anche se la pcr non e il massimo e devo farla un paio di volte per essere sicura del risultato, non sarebbe un probl.


Ad ogni modo, a me viene uno smear a meta del gel... piu o meno intenso nei vari cmpioni... Ovviamente uso campioni gia genotipizzaz;

Voi come provereste?
Ascoltami con gli occhi...

gilthanas
Nuovo Arrivato

0116_da_CIA



100 Messaggi
Inserito il - 04 settembre 2010 : 18:22:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di gilthanas Invia a gilthanas un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
cosa significa a metà del gel??

intendi dire a metà della corsa rispetto ad un marker di peso molecolare???

dipende dal marker che usi...potrebbe essere a livello delle 100 bp ed in quel caso potrebbero essere dimers dei primers...

altrimenti potrebbero essere diverse forme di splicing del tuo gene in studio comprese tra i 2 primers che usi..

la cosa più probabile però è che la PCR non stia funzionando...
io fare un gradiente di temperatura di annealing...se a 58 gradi non ti è venuto nulla devi abbassare la T non alzarla...se ti son venute tante bande devi inceve alzarla...
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Gst
Utente Junior


Prov.: Roma
Città: Ariccia


143 Messaggi
Inserito il - 05 settembre 2010 : 14:33:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gst Invia a Gst un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Hai ragione... nn sono stata troppo chiara...

a metà gel sta per 500-700 bp nel mio caso: dunque non sono certo primers! Inoltre non sono bande discrete, ma una sorta di smear!

Pensavo: potrebbe essere dovuto a troppo materiale?

Comunque proverò sicuramente a fare la pcr in doppio: mettendo la stessa quantità di stampo usata e la metà. Inoltre proverò temperature da 58°C a scendere.
Che ne dici?

Grazie per la risp!

P.S. il tentativo di alzarla a 65°C era perchè vecchie persone del lab mi avevano detto che in passato quei primers erno stati usati da loro con quella temperatura.
Ascoltami con gli occhi...
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