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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
 Inserito il - 28 gennaio 2011 : 16:39:08
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Buongiorno ragazzi ho assolutamente bisogno di aiuto...ma vi spiego tutto da capo.
Devo amplificare un tratto del gene che codifica per i recettori degli androgeni dove è contenuto un polimorfismo. Dato che il gene si trova sul cromosoma X e che valuto il tutto nelle donne, prima dell'amplificazione vado a valutare quale è l'allele attivo mediante una digestione. Nel caso di allele attivo ho il sito di restrizione dei mie enzimi libero da metilasi, quando è inattivo invece avrò un gruppo metile e quindi l'allele in questione non verrà digerito. Infine, in sede di sequenziamento dei microsatelliti, confronto il campione digerito con quello di controllo (non digerito) per vedere qual'è l'allele attivo.
Inizialemente usavo 25 ng di DNa per digerire e da qui prendevo 2 microlitri per la PCR. Successivamente ho aumentato le quantità di DNA a 250 ng perchè la reazione non era abbastanza efficiente. Ho anche aumentato i primers da 0,2 micromolare a 1 micromolare.
Con queste ultime condizioni andava abbstanza bene, ma all'improvviso hanno smesso di venirmi le PCR. Ho cambiato DNA, aliquote di primers, di MG e di dNTPS ma niente.
Ho però lasciato la stessa quantità di Taq potrebbe non essere abbstanza dato che ho aumentato la quantità di DNA?
I primers in eccesso potrebbero inibire la Taq?
I dNTPs potrebbero non essere abbstanza?
Non ho il bianco contaminato quindi non credo ci sia qualche contaminazione....
Inoltre ho pulito benissimo (quasi in modo maniacale) pipette, bancone, ecc...
Aiutatemi vi prego!!!
Sto impazzendo!!!!
Grazie mille
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 28 gennaio 2011 : 17:54:48
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| nn è ke semplicemente ti si è scassata la Taq? |
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Gabry
Nuovo Arrivato
Prov.: Ancona
Città: santa maria nuova
64 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2011 : 15:16:25
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non credo che si sia scassata la Taq... quelle di ultima generazione sono molto resistenti... però per evitare problemi proverei a controllare con un campione positivo...
forse dico una cavolata ma potrebbe essere che il dna è troppo metilato e la PCR non funziona? non so se è possibile. ma mi sembra strano che con piccole quantità la prova viene e aumentando di 10 volte la quantità di dna la pcr non viene più... |
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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 02 febbraio 2011 : 12:00:50
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Ciao ragazzi.
Ho provato a cambiare Taq (che però è dello stesso lotto di quella vecchia), a tornare alla quantità di primers vecchia (0,2 micromolare), a cambiare DNa...ma ancora niente!!!
Non so più che fare!!!
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 02 febbraio 2011 : 14:11:09
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secondo me allora è veram la Taq andata, tanto più ke cprendendone una dello stesso lotto nn funziona!
o magari se nn è lei è qualche altro reagente che non lavora cm dovrebbe( tipo il buffer, il mg ecc...), ma siccome avevi già provato a cambiarle senza successo, resta solo la taq... |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 02 febbraio 2011 : 14:12:14
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| domanda: tu sei sicura che i primers che usi annilino bene cn il DNA stampo vero?e che i cicli che usi siano adatti? |
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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 03 febbraio 2011 : 16:56:33
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Ragazzi oggi abbiamo provato con lo stesso campione di ieri e le stesse condizioni (compreso di stessi reagenti) e finalmente è tornata a venire. L'0unica cosa che abbiamo cambiato è il termociclatore.....
A questo punto direi che la soluzione dell'arcano sta nel termociclatore....è sminchiato!!!
Ma voi avete idee di come faccio a provare che il tremociclatore raggiunga e mantenga le temperature giuste?
Posso solo affidarmi all'assistenza? |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2011 : 00:36:07
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ehmm...non c'e' scritto sul display |
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dannate pcr
Didattica
