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Discussione |
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GENDET56
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
 Inserito il - 08 agosto 2005 : 20:04:41
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Mi potete spiegare l' s1 mapping e la foot printing ?
GRAZIE
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Cittā: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
Inserito il - 08 agosto 2005 : 20:42:28
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Ugh! ;)
Se vuoi un consiglio, l's1 e il foot printing li trovi spiegati molto bene sul libro 'Weaver - Molecolar Biology' della McGraw Hill. Sul Gene VI non era granche'... |
Il mio blog di bioinformatics (inglese): BioinfoBlog
Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-) |
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chick80
Moderatore
Cittā: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 09 agosto 2005 : 01:09:10
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Non so/non ricordo nulla sull'S1 mapping, ma posso spiegarti in breve il footprinting.
In pratica il footprinting e' una tecnica che permette di vedere dove una proteina lega il DNA.
Immagina di avere una certa sequenza di DNA diciamo di 2000bp, le cui basi da 500 a 510 sono il sito di legame di una proteina X (ho molta fantasia nei nomi... )
Per fare il footprinting devi:
1) marcare un'estremita' del DNA in qualche modo (solitamente con un nucleotide radioattivo)
2) Incubare il DNA con la proteina X in opportune condizioni, in modo che si abbia un legame stabile
3) Digerire con DNAsi I che taglia randomly il DNA. E' importante che la digestione sia abbastanza blanda, in modo da avere piu' o meno un solo taglio per ogni molecola di DNA.
4) Avrai quindi un mix di molecole con un'estremita' radioattiva di varia lunghezza. Tuttavia poiche' X era legata al DNA, la DNAsi non avra' potuto accedere alle basi 500-510 e quindi non avra' potuto tagliare li' in mezzo. Avrai quindi frammenti da poche bp fino a 500 e da 510 fino a 2000. Fai un'elettroforesi su gel di poliacrilamide e poi un autoradiogramma. Vedrai tante bande con un "buco" tra le basi 500 e 510 e cosi' potrai dire che X si lega in quel sito.
In realta' a causa di possibili strutture 3D e dell'ingombro della proteina di solito le basi "protette" sono un po' di piu' (nel nostro es. potrebbero mancare i frammenti da 490 a 520), quindi puoi utilizzare altre tecniche (es. delezioni consecutive) per capire piu' precisamente dove la proteina si lega.
nICO |
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GENDET56
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 09 agosto 2005 : 11:06:24
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Ci sono siti internet dove vengono trattati con maggiore dettaglio?
Purtroppo ho come libro Genetica princioi di analisi formale del Griffiths suzuki casa ed. Zanichelli.
GRAZIE. |
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Cittā: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
Inserito il - 09 agosto 2005 : 12:00:53
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ok, per questa volta passi.... ma il Griffits non e' un libro di genetica?
L'S1 mapping e' una tecnica per individuare il 5' o il 3' di un trascritto.
Tu conosci la sequenza del gene, pero' non sai esattamente dove inizi la trascrizione (infatti a me l'hanno spiegata a Biol. Mol. 1 per farci capire dove comincia la a lavorare la polimerasi e come maturano gli RNA)
Ti costruisci una sonda di DNA specifica per il tuo trascritto, facendo attenzione che sia abbastanza lunga ed in una posizione tale da coprire quello che pensi sia il 5' (o 3') dell'RNA.
Visto che la costruisci tu sai gia' in quale punto iniziera' ad appaiarsi.
Marchi la tua sonda (es P 32 al 5') e la fai ibridare con il tuo RNA (o con una popolaz. di RNA tra cui ci sia il tuo trascritto)
Ottieni un ibrido DNA/RNA di questo tipo:
AAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTTTTTTTTTTTT <- questa e' la tua sonda
GGGGGGGGGGGGGGGGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAACCCCCCCCCCGG.... <- questa e' l'estremita' al 5' del tuo RNA
AAAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTTTTTTTTTTTTGGGGGGGGGGCC <- questo e' il tuo gene
TTTTTTTTTTTTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAACCCCCCCCCCGG....
0123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890123456789012345
0 1 2 3 4 5 6 7 <- sai che la tua sonda si ibridizzera' dalla posiz. 02 alla 75
A questo punto usi l'esonucleasi S1, che e' un enzima capace di degradare selettivamente solo gli acidi nucleici a singola elica. Quindi in questo modo elimini tutti gli acidi n. che non si sono ibridizzati, e del tuo ibrido ti rimane solo la parte a ds:
CCCCCCCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTTTTTTTTTTTT <- questa e' la tua sonda
GGGGGGGGGGGGGGGGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAA <- questa e' l'estremita' al 5' del tuo RNA
AAAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTTTTTTTTTTTTGGGGGGGGGGCC <- questo e' il tuo gene
TTTTTTTTTTTTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAACCCCCCCCCCGG....
0123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890123456789012345
0 1 2 3 4 5 6 7 <- ok l'elettroforesi ti dice che ibrido RNA/DNA e' lungo 58 bp, quindi il punto di inizio del trascritto e' al punto 75 - 58 = 17
Ora tramite elettroforesi puoi ottenere la lunghezza di questo ibrido, e da questa, visto che sapevi il punto esatto in cui la tua sonda iniziava ad ibridizzarsi (al suo 5') puoi risalire al 5' del trascritto che ti interessava.
p.s. e con questo messaggio ho detto abbastanza (cavolate) per arrivare alla segunda estrella!!  |
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GENDET56
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 09 agosto 2005 : 19:20:17
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| GRAZIE. |
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lumi
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2007 : 11:33:36
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ragazzi scusate se mi intrometto ma c sono delle problematiche che nn riesco a spiegarmi.....es:
come faccio ad essere sicura di marcare solo uno dei 2 filamenti di dna?
ringrazio anticipatamente chi vorrā rispondermi.... |
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chick80
Moderatore
Cittā: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2007 : 12:23:31
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Intendi come fai a marcare solo l'estremitā 5'?
Esistono enzimi che aggiungono nucleotidi solo al 5' o solo al 3' (mi sfuggono i nomi al momento...) e
quindi puoi incubare la tua sonda con un nucleotide marcato e questo enzima e hai marcato solo un'estremitā! |
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lumi
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 24 febbraio 2007 : 12:19:42
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si ma nella tecnica del footprinting l'estremitā da marcare(metti caso 3')dev'essere quella di
UNO dei filamenti di dna e non di entrambi i falamenti della doppia catena...prendiamo la dna polimerasi...
si lega su uno dei 2 filamenti di dna,per cui se marco entrambe le estremitā 3' non ottengo nulla quando vado
a fare l'elettroforesi...
ora,come faccio a mercare solo 3' d un solo filamento? |
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Luis 22
Utente
Cittā: Bari
755 Messaggi |
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moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 27 maggio 2007 : 19:24:12
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Intendi come fai a marcare solo l'estremitā 5'?
Esistono enzimi che aggiungono nucleotidi solo al 5' o solo al 3' (mi sfuggono i nomi al momento...) e
quindi puoi incubare la tua sonda con un nucleotide marcato e questo enzima e hai marcato solo un'estremitā!
Uno di questi č la T4 kinasi,con la quale puoi marcare al 5' un filamento di Dna partendo da gamma 32P ATP |
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Cangrande
Utente Junior
Prov.: Verona
280 Messaggi |
Inserito il - 30 maggio 2007 : 15:01:29
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Anche le TERMINAL TRANSFERASI attaccano all'estremitā 5' i nucleotidi che mettiamo nel tubo.
es. XXXXXXXXXXXXXXXXX + dGTP + TERMINAL TRANSFERASI
GGGGGXXXXXXXXXXXXXXXXX |
Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala. |
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ANDREA@
Nuovo Arrivato
Prov.: Lecce
Cittā: LEVERANO
3 Messaggi |
Inserito il - 11 settembre 2007 : 22:29:44
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scusatemi se mi intrometto, ma la S1 degrada solo il singolo filamento di sx della sonda?  |
A |
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ANDREA@
Nuovo Arrivato
Prov.: Lecce
Cittā: LEVERANO
3 Messaggi |
Inserito il - 11 settembre 2007 : 22:57:02
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| se la S1 degrada i singoli filamenti, quei 17 nucleotidi non sono quelli totali, derivati sia dalla degradazione del singolo filamento della sonda che del singolo filamento dell' RNA..... |
A |
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Il_Lup
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 19 febbraio 2011 : 10:59:21
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lumi costruisci la sonda con un sito di restrizione vicino l'estremitā da eliminare e non vicino l'altra , in questo modo
una volta marcate entrambe le estremitā puoi eliminarne una.
Scusate ma non capisco le estremitā 5' e 3' dal disegno....sarā panico da esame OO
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Discussione |
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S1 MAPPING & FOOT PRINTING
Inserito il - 24 febbraio 2007 : 15:37:27
