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Discussione |
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karmax
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 23 febbraio 2011 : 13:39:54
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Salve a tutti, sto inixiando a lavorare con i batteri, fino ad ora mi sono limitato a metterli in contatto con le cellule per analizzare la modifica di alcuni recettori mediante PCR. adesso ho bisogno di valutare l'effetto del solo DNA batterico. mi sapreste indicare un metodo semplice e veloce per estrarre DNA da colture (in brodo) di E. Coli?
grazie
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edilioilre
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 17:47:20
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solita prassi:
-lisi cellulare (magari gli dai una soluzione isotonica)
-levi le proteine trattando con proteasi
-rimuovi tutti gli rna con rnasi
-poi devi fare precipitare io utilizzerei isopropanolo ne serve meno ma forse è più difficile da rimuovere vedi un pò
-rimuovi i sali in eccesso con etanolo e disidrati
-poi reidrati in soluzione e lo tieni al fresco a 4C
ricordati di aggiungerci dei sali per neutralizzare le cariche negative del dna altrimenti si respingono poi potresti aggiungerci alcool cosi si aggrega meglio |
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silvietta82
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 23:35:56
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Ciao, è come ha spiegato edilioilre. Volevo aggiungere che esistono dei kit per miniprep, midi e maxi..es. della quiagen o della promega...sono rapidi e di semplice utilizzo; forinscono tutti i buffer necessari. In effetti in questi kit dopo lisi e proteasi si purifica il DNA in colonnine (lavaggi-eluizione)...non ho mai fatto caso ma è possiile che i wash buffer contengano RNAsi
Io è solo qualche mese che lavoro con i batteri, è interessante l'idea di non dover dipendere da questi kit (seppur comodi). Volevo quindi chiedere a Edilioilre se è possibile avere qualche suo protocollo (che sfacciataggine :D)
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 23:38:56
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| la RNAsi c'e' nel resuspension buffer di solito e ce la metti tu data dal kit |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 23:41:06
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Un conto è il DNA batterico (genomico!), un altro ben diverso il DNA plasmidico!
Con i kit mini-midi o maxi-prep isoli il DNA plasmidico!
Comunque sia è possibile isolare anche il DNA plasmidico senza kit, esistono dei protocolli anche per quello!
Comunque karmax tu cosa devi isolare?
Se è DNA genomico ti consiglio di dare un'occhiata qui: http://www.protocol-online.org/prot/Microbiology/Bacteria/Nucleic_Acid_Extraction/index.html
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karmax
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 24 febbraio 2011 : 10:53:33
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| Innanzitutto grazie per le risposte...io devo isolare DNA genomico, ho dato un'occhiata ai tuoi link, edilioilre, e penso che utilizzerò il protocollo con fenolo\cloroformio(Jeffrey D. Newman, Lycoming College), perchè utilizza reagenti che ho già a disposizione. Solo una cosa, ma il DNA, una volta estratto, lo conservo a -80°C? |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 24 febbraio 2011 : 11:25:52
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| -20 in TE va piu' che bene |
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silvietta82
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 25 febbraio 2011 : 14:50:52
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| E già, scusate. |
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etrazione DNA da E Coli
Didattica
