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 Inserito il - 05 giugno 2012 : 09:06:29
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ciao a tutti.
in questi giorni sto testando i primer che ho disegnato con primer3 mediante pcr gradiente.. nel gel d'agarosio ho visto poi che c'erano per alcuni primer bande molto alte (il mio prodotto della pcr è sulle 200 pb).. questo cosa vuol dire che i primer si sono attaccati a a dna genomico? altra cosa che chiedo è: nel caso di formazione di dimeri..come sono le bande nel gel?
i primer li avevo disegnati con primer3 e poi li avevo controllati con operon.com...e mi ero assicurata che non formassero dimeri. poi li avevo controllati in blast.. a questo punto forse ho sbagliato a scegliere gli esoni in cui trovare i primers.. ma voelvo chiedere allora, nel caso un gene avesse più trascritti..nel scegliere l'esone (essendo che nn ho preferenze sul trascritto) devo scegliere esoni che sono comuni?
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Roby.B
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 Inserito il - 05 giugno 2012 : 13:11:15
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Sono nuova anche io, da premettere che ho l'esame di biologia molecolare tra due giorni ! come programma per costruire i primer, il Prof ne ha consigliato uno ottimo, è Net Primer, dice tutto, se si formano dimeri, loops ecc ecc, oppure un programma "Oligos" che però si deve scaricare .... il primer so che deve essere creato a cavallo di due introni (non so se c'entra qualcosa), cmq proprio tra 1 oretta vado al ricevimento e chiederò come sono le bande nel gel se si formano dimeri ! hihihihih
(è una materia fantastica *_*) |
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283
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Inserito il - 05 giugno 2012 : 18:47:17
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si è davvero una disciplina fantastica..anche se essendo una alle prime armi mi sento un pò "superba" nel dirlo...
cmq grazie mille della risposta,attendo tue news. |
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GFPina
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Inserito il - 05 giugno 2012 : 19:36:53
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283 potresti essere più specifica?
Citazione:
nel gel d'agarosio ho visto poi che c'erano per alcuni primer bande molto alte (il mio prodotto della pcr è sulle 200 pb)
alte quanto? Il tuo prodotto giusto c'era?
Citazione:
questo cosa vuol dire che i primer si sono attaccati a a dna genomico?
Non so, è possibile che si attaccassero? Come li hai disegnati? Nel caso si attaccassero a DNA genomico quella è l'altezza delle bande che ti attenderesti?
Citazione:
nel caso di formazione di dimeri..come sono le bande nel gel?
le bande dei dimeri in genere sono basse, attorno ai 50bp
trovo solo immagini tremende sul webm, comunque sono qualcosa di questo tipo:
Qua li vedi nel campione 1, mentre in 2 e 3 sono stati rimossi.
In genere comunque se non hai amplificato vedi i primers infondo al gel, se nei tuoi campioni hai messo anche un controllo negativo (cosa che dovresti aver fatto) lì dovresti vederli, mentre nei campioni se è avvenuta amplificazione non dovresti vederli o dovresti vederne pochi.
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283
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Inserito il - 05 giugno 2012 : 22:07:01
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grande! grazie per la risposta..
allora non sono dimeri..anche perchè (ammesso che poi la realtà si conformi ai calcoli) li avevi testati con operon.com dove non avevo dimeri.
le bande erano verso 500pb però non so come predire la grandezza dell'eventuale amplificato a dna genomico (scusa ma sai che sto imparando ora) |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2012 : 22:09:50
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Basta che prendi la sequenza del genomico e vai a vedere dove si possono attaccare i primers.
Praticamente la grandezza sarà quella dell'amplificato da cDNA più gli introni che ci sono in mezzo agli esoni coinvolti.
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283
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Inserito il - 05 giugno 2012 : 22:11:41
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aggiungo poi che per un gene invece c'erano solo tante bande ravvicinate tipo smear (se ho capito bene)..e nel caso dei primer con la banda alta..c'era anche il prodotto atteso.
li avevo disegnati con primer tre, controllati con operon.come e poi blastati. quindi in realtà per quanto fosser oprevisti "buoni" come primers..poi nn è stato così.. per cui nn ho capito da cosa fosse dovuto perchè ci ho impiegato tanto tempo a disegnarli escludendo qquelli che davano dimeri ecc.. |
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283
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Inserito il - 05 giugno 2012 : 22:16:34
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| "Basta che prendi la sequenza del genomico e vai a vedere dove si possono attaccare i primers."... potresti dirmi come si fa? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2012 : 22:32:59
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Prendi la sequenza del tuo gene e utilizzi un programma di analisi di primers o uno di allineamento di sequenze per vedere dove si attaccano i primers.
Ancora non ho capito come li hai disegnati i primers, se sono all'interno di un esone o a cavallo di due esoni.
Comunque sapendo dove si attaccano sul cDNA puoi anche andare a vedere semplicemente che introni ci sono in mezzo a quegli esoni nel DNA.
Lo smear può essere dovuto ad amplificazione aspecifica, prova a cambiare le condizioni della PCR.
Come ti dicevamo quando hai chiesto per il disegno dei primers, non esiste il primer perfetto e comunque quello che è buono sulla carta non necessariamente lo è in pratica, vanno testati. |
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ericuccia88
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Inserito il - 06 giugno 2012 : 22:02:44
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SE vuoi eliminare prodotti aspecifici puoi provare ad alzare la T di annealing!!Quale è la Tm dei tuoi primers?
Prova ad andare su UCSC- PCR e metti la sequenza dei tuoi primers, così puoi vedere le dimensioni effettive dell'amplicone!!
ciaoo |
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283
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115 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2012 : 22:38:50
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grazie mille! ottima risposta!
la tm dei primer prevista da primer3 era sui 60°C |
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283
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115 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2012 : 16:09:42
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ho provato ad usare il programma che mi hai indicato e nella sezione in silico pcr volevo sapere se devo modificare qualche parametro.
grazie mille. |
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