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DNA complessi complessi DNA-proteina DNA-proteina ChIP cesio frazionamento purificazione

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Hymmelman
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Inserito il - 01 dicembre 2014 : 21:52:32

Ciao a tutti, ho una questione spinosa da porvi....

in laboratorio stiamo cercando un modo per visualizzare e quantificare il legame di una proteina al DNA. voi direte, nulla di pi� facile ma ecco i problemi:il legame � sequenza aspecifico ed il nostro obbiettivo � vedere come tale legame cambia in diverse condizioni.

Abbiamo provato analizzando per western la proteina legata alla cromatina ottenuta grazie alla prima parte del protocollo di ChIP. il problema � che fermandoci prima dell'IP oltre alla proteina legata al DNA (di interesse) si vede anche la proteina libera, ancora presente dopo la sonicazione e conseguente solubilizzazione della cromatina.

c'� un modo per separare il complesso DNA-proteina dalla proteina libera senza dover ricorrere al frazionamento tramite gradiente di cesio????

in poche parole ci� di cui avrei bisogno � un sistema per purificare il DNA a cui � legata la proteina. (fate per� conto che l'analisi che devo fare � in vivo, il DNA non � marcato e la sua sequenza ignota visto che il legame della proteina � seq-aspecifico)

non esiste qualcosa che legando il solo DNA pu� essere sfruttato per precipitare il DNA stesso insieme alla proteina legata?

stavo pensando anche ad un altra alternativa: si potrebbe sfruttare in qualche modo il gel retardation assey? posso caricarvi direttamente il campione di cromatina chiarificata ottenuta dalla ChIP (campione che ha il complex DNA-proteina di interesse oltre alla proteina libera). secondo voi poi la proteina libera migrerebbe in modo diverso dal complesso visto che cmq i frammenti di DNA ottenuti dalla sonicazione della cromatina sono lunghi circa 500bp. nel caso 500bp sono troppe?

spero di essermi spiegato

e spero che qualcuno abbia la pazienza di leggere tutto :)