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Discussione |
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kakybiotech
Nuovo Arrivato
Prov.: Macerata
Città: Camerino
21 Messaggi |
 Inserito il - 15 dicembre 2007 : 14:42:52
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Salve a tutti,
vorrei chiedervi una mano per quanto riguarda la possibilità di reperire dei protocolli già utilizzati e dei suggerimenti per ilclonaggio del mio gene di interesse in un vettore di espressione contenente la GFP...
GRAZIE
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2007 : 13:48:06
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Ciao io per clonare i miei geni di interesse in vettori di clonaggio con GFP o dei Tag utilizzo la tecnologia Gateway dell'invitrogen.
Altrimenti devi fare una cosa più artigianale con le ligasi..
..ora non ho il mio computer con me ma alcuni protocolli ce li ho.
Intanto guardare il Topocloning GW8 chè è un sistema Gateway che sfrutta le topoisomerasi per clonare il tuo prodotto di PCR all'entry clone.
Potrbbe esserti utile
Ciao.
-Lorenzo |
www.tlbspazio.it
Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2007 : 14:23:59
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Quoto Lorenzo, anch'io ho sempre usato Gateway e Topo Cloning per fare i miei vettori!
Se devi iniziare ti consiglio di partire a fare l'entry vector con TOPO che è più facile e poi passi al vettore di espressione con Gateway. Sul sito dell'Invitrogen trovi tutto.
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kakybiotech
Nuovo Arrivato
Prov.: Macerata
Città: Camerino
21 Messaggi |
 Inserito il - 16 dicembre 2007 : 21:47:37
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Grazie mille ad entrambi, i vostri consigli mi sono veramante utili anche a te Lorenzo se potessi consultare i tuoi protocolli ti sarei infinitamente grato
a presto
-Carmen- |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 18 dicembre 2007 : 20:26:06
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per EGFP intendi che deve essere espresso a parte oppure devi fare delle proteine chimeriche?
Se intendi la seconda ci sono dei vettori appositi, si chiamano EGFP-C1, EGFP-C2, EGFP-C3 per clonaggi al C-terminale di EGFP nei tre frame di lettura ed i vettori EGFP-N1, EGFP-N2 e EGFP-N3 per i clonaggi alll'N-terminale.
sono commerciali ma li trovi anche in diversi laboratori, le mappe le trovi su internet.
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
Inserito il - 19 dicembre 2007 : 12:28:32
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Karybiotek Says:
"Grazie mille ad entrambi, i vostri consigli mi sono veramante utili anche a te Lorenzo se potessi consultare i tuoi protocolli ti sarei infinitamente grato
a presto"
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TAPPE PRINCIPALI DI UN CLONAGGIO GENICO
-Disegnare i Primers con siti di restrizione opportuni per il clonaggio da effettuare (es. OLIGO).
Amplificare mediante PCR la sequenza genomica di interesse.
-Controllare l'amplificato su minigel di Agarosio.
-Purificare il prodotto di PCR per il clonaggio:
1.Eluizione da gel di Agarosio (Jetsorb, resine varie, freeze-squeeze ecc.).
2.Purificazione e concentrazione tramite filtri. Kit
-Digerire gli inserti con enzimi di restrizione scelti per il clonaggio (10ul volume di digestione, 1 ul enzime).
-Purificare il frammento digerito con microcon, meglio che con Jetsorb.
-Plasmidi: Si preparano delle midipreps per ottenere una buona resa di plasmide. Esso viene digerito con enzimi scelti come siti di clonaggio e purificato dopo digestione .
LIGATION
Si prepara un minigel di agarosio sul quale si caricano plasmide linearizzato purificato e inserto da clonare digerito e purificato per valutare le CONCENTRAZIONI relative.
Correlare le concentrazioni del DNA-Double Strand con l' analisi spettrofotometrica.
Il rapporto vettore :inserto dovrebbe essere 3:1, ma consideranconsiderando che il plasmide linearizzato è circa 3 volte più lungo della sequenza da clonare, si scelgono quantità i(volumi in microlitri) dei d2 DNA comparabili (!;!).
-Volume di reazione 10 ul, di cui:
DNA vettore Calcola
DNAinserto Calcola tu quanto
T4Ligasi 1ul
Buffer Ligation 10x 1ul
Acqua sterile Fino a Volume 10ul
Controlli: Sono costituiti dalla ligation effettuata sul vettore in assenza di inserto.
La quantità di DNA plasmidico dei controlli deve essere uguale a quella impiegata nei campioni.
-Incubare O.N. a 16°C oppure a 4-5 ore a R.T.
-Screenare il nuovo plasmide utilizzando prima le digestioni poi il sequenziamento.
-Le ligation si usano inizialmente per trasfettare batteri competenti mediante elettroporazione.
P.S.
Già sai come lavorare in queste tecniche in Ghiaccio per preservare gli enzimi compreso la ligasi. |
www.tlbspazio.it
Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi |
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
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