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biocandy
Utente Junior

370 Messaggi

Inserito il - 29 maggio 2015 : 20:28:12

Ciao a tutti! sto cercando di estrarre proteine da cellule in sospensione. Quello che faccio � questo:
- parto da 10 milioni di cellule
- lavo il pellet due volte con PBS centrifugando 1000 rpm per cinque minuti
- aggiungo al pellet 500 ul di RIPA buffer freddo a cui sono stati aggiunti (immediatamente prima dell'uso) 5 ul di cocktail di inibitori proteasi/fosfatasi (lo stock � 100X)
- vortexo 15 secondi
- incubo in ghiaccio 30 minuti
- centrifugo 13000 rmp per 30 minuti a 4 gradi
- prelevo il surnatante ed elimino il pellet

Non so per quale motivo ottengo delle rese bassissime! da 0.2 a 0.5 ug/ul di proteine! Cosa posso fare per aumentare la resa? avete consigli da darmi o protocolli da suggerire?
Grazie mille!

Geeko
Utente

Citt�: Milano

1043 Messaggi

Inserito il - 29 maggio 2015 : 22:30:54

Scritto da MolecularLab Mobile

Intanto so che esistono varie ricette per i buffer comunemente chiamati "RIPA"... il tuo che RIPA �?
Poi le prime due cose che mi vengono da dire sono: controllato di non perderti delle cellule nei lavaggi col PBS (il pellet � sempre lo stesso?) e hai provato a ridurre il volume di RIPA che usi (in modo da aumentare la concentrazione dell'estratto)?
Se con questi accorgimenti hai ancora problemi vuol dire che c'� qualche difetto di estrazione delle proteine con questo buffer..

biocandy
Utente Junior

370 Messaggi

Inserito il - 30 maggio 2015 : 11:42:42

Ciao! Grazie per la tua risposta. Il RIPA buffer che uso io �

1mM EDTA
50 mM TRIS-HCl pH 7.4
1% Triton X100
0.2% sodio idrossicolato
0.2% SDS
dH2O

Quando faccio i lavaggi con PBS faccio attenzione a non portare via il pellet e a occhio mi sembra sempre lo stesso. Inoltre non ho mai provato a diminuire il volume di RIPA in quanto mi � stato detto che va sempre mantenuto un certo volume di buffer per numero di cellule altrimenti i detergenti non lisano le membrane. Posso comunque provare a farlo e vedere come va!

Geeko
Utente

Citt�: Milano

1043 Messaggi

Inserito il - 30 maggio 2015 : 12:58:28

Scritto da MolecularLab Mobile

Io come prima cosa ridurrei il volume di buffer che usi (anche se 500 uL non mi sembra esagerato...proverei con un 350 per cominciare). Altrimenti puoi usare un buffer di lisi a base di solo NP-40 come detergente, con cui mi sono trovato abbastanza bene io (dipende anche da cosa devi poi farci con gli estratti).

Cerny-Ruze
Nuovo Arrivato

6 Messaggi

Inserito il - 07 agosto 2015 : 15:03:18

Ciao,
io ho il tuo medesimo problema!!
Le mie cellule sono adipociti maturi e crescono adese alla piastra, per la lisi utilizzo 900ul di TFA 0.1% per una petri da 10cm.

Per concentrare le proteine mi hanno consigliato di liofilizzare il lisato (avendo un liofilizzatore.....), ma dipende da cosa devi fare dopo...se � un liofilizzatore a caldo, potresti avere problemi di degradazione!