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simone crescenzo
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 Inserito il - 31 maggio 2018 : 21:50:57
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Ciao ragazzi. Vorrei un consiglio.. cerco di spiegare il mio problema. Per il mio lavoro di tesi, sto facendo delle estrazione di DNA genomico col metodo Salting Out da CAMPIONI DI MUSCOLO DI PESCE (alcuni abbastanza vecchi, risalgono al 2009. Il problema è che alcune volte gli estratti mi escono particolarmente sporchi e di conseguenza, nella fase successiva, non ottengo un amplificato in PCR (ho provato a diluire il campione ad una diluizione 1:10 ma nulla, non mi amplifica nulla). All'inizio ho pensato che era un problema di PCR (primer o qualche altro reagente) e invece no! Infatti per alcuni campioni (nonostante l'estratto sia un pò "sporco") riesco ad ottenere l'amplificato mentre per altri no!
Ho cercato di fare un lavaggio in più con etanolo al 70% durante la procedura di estrazione ed anche questo tentativo sembra non aver avuto risultati positivi.
Sono arrivato a pensare al tempo di digestione; nel mio caso, la digestione con proteasi K è di 2 ore. Volevo prolungare la digestione over-night di modo da dare la possibilità di digerire perfettamente il muscolo. Che ne pensate?
Ho anche pensato di ripurificare l'estratto. Normalmente il DNA al termine dell'estrazione lo risospendo con 30 microlitri di acqua Sigma. Volevo prendere questi 30 microlitri e sottoportli ad un lavaggio in etanolo al 70% (ma che quantità uso di etanolo 70%)... che ne pensate???
La mia prof dice che probabilmente i campioni forse si sono rovinati e quindi capita che alcuni possono dare problemi.
La cosa che mi preme di più da voi è avere un consiglio su come ridurre la quantità di "sporcizzia" residua che mi rimane al termine dell'estrazione.
GRAZIE MILLE A TUTTI PER UN'EVENTUALE RISPOSTA.
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Didattica
