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Autore

Discussione

fideb
Nuovo Arrivato

Citt�: Potenza

54 Messaggi

Inserito il - 11 giugno 2011 : 16:35:07

Ciao!ho un piccolo problema nell'amplificare il mio gene con la PFU. Inizialmente ho utilizzato la Taq ed ho ottenuto il mio amplificato. Dovendo clonare il mio gene, sono passata alla PFU. Ho seguito tutte le indicazioni nel manuale della PFU eccezion fatta per un paramentro: nel protocollo annesso dice di fare una denaturazione iniziale a 95�C per 1-2 min e poi una denaturazione a 95�C per 0.5-1 min. Io invece per una svista ho impostato 94�C per 2 min come denaturazione iniziale e 94�C per 30'' nel successivo step di denaturazione. Ci� pu� aver causato l'assenza di amplificato?

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 11 giugno 2011 : 19:34:26

Non sei n� la prima n� l'ultima ad avere problemi con la Pfu, in genere quello che viene con la Taq l'80% delle volte non viene con la Pfu!
E' un enzima molto esigente e devi cambiare un po' di condizioni, e il problema non � certo quel grado in meno nella denaturazione.
Guarda ad es. questa discussione: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=10168

fideb
Nuovo Arrivato

Citt�: Potenza

54 Messaggi

Inserito il - 11 giugno 2011 : 20:24:09

Si, avevo gi� dato un occhio...grazie mille!