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le990
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 07 ottobre 2017 : 10:59:53
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Buongiorno a tutti,
ho alcuni problemi con la melting curve di un gene...vi allego immagine per essere più chiara...mi si forma un prodotto aspecifico..secondo voi è legato a dimessi di primers? ho provato ad alzare la temperatura fino a 63°C... avete suggerimenti in merito? come posso procedere? secondo voi devo ridisegnare i primers?
grazie per chi potrà aiutarmi
Immagine:
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Caffey
Utente Attivo
Città: Perugia
1496 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2017 : 11:38:17
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Ciao.
Spero che qualche moderatore incroci questa discussione e riduca le dimensioni dell'immagine che hai caricato.
In ogni caso a me il primo picco sembra proprio dei dimer di primer.
Se non ti dispiace, potresti dirci la sequenza dei tuoi primer cosicché possa verificare una cosa? |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2017 : 11:52:24
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| Anche a me sembra un dimero, hai provato a caricare su gel il prodotto di PCR? Puoi provare a testare altre temperature di annealing, più alte di 63°C. Se il tuo termociclatore te lo consente puoi provare con un gradiente usando anche varie diluizioni (di 10 in 10) di un campione di prova per testare anche l'efficienza e con una singola corsa magari trovi già la temperatura ottimale. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2017 : 18:12:17
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Citazione:
Messaggio inserito da Caffey
Spero che qualche moderatore incroci questa discussione e riduca le dimensioni dell'immagine che hai caricato.
Fatto! 
Comunque, sì anche a me sembrano dimeri di primers!
Mi associo alle risposte precenti.
Dovresti anche analizzare i tuoi primers con un programma di analisi di primers per vedere se formano dimeri.
Inoltre puoi fare delle PCR end-point a diverse temperature per cercare di risolvere il problema e trovare le condizioni ottimali prima di rifare la real-time. |
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le990
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2017 : 16:48:42
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Grazie per le vostre risposte,
ho inserito i primers nel programma "Amplify" e non sembrano formare dimeri...proverò comunque ad alzare la temperatura come mi avete suggerito...se avete altri suggerimenti sono ben accetti :) |
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