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masna
Nuovo Arrivato
74 Messaggi |
 Inserito il - 07 marzo 2013 : 20:33:34
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Salve ragazzi, ho una domanda per voi! Oggi il prof ci ha lasciato con questo quesito, e sinceramente non so dare una risposta.
Allora, la questione č questa: ho un frammento che voglio clonare, e suppongo che alle estremitā ci siano le sequenze per gli enzimi di restrizione che voglio usare.
Ammettiamo che metta assieme gli enzimi ed il frammento, e dopo faccia una PAGE per il frammento non tagliato, e per il frammento sottoposto a digestione con gli enzimi di restrizione.
Il problema sorge dal momento che i nucleotidi che dovrebbero essere tagliati alle due estremitā sono pochi, e quindi confrontando i risultati della PAGE non si riesce a stabilire se gli enzimi hanno effettivamente tagliato.
Come posso capire se gli enzimi hanno funzionato senza fare cose troppo complesse?
Ci ha giā detto che la risposta non č un gel di poliacrilammide.
Ringrazio chiunque voglia rispondere!
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SpemannOrganizer
Utente
Cittā: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 08 marzo 2013 : 00:44:54
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| mah... io un'idea ce l'avrei, poi nn so se effettivamente si usa fare cosi'... potresti trattare il tuo frammento di DNA (prima della digestione) con una chinasi in presenza di fosfato radioattivo, in modo da aggiungere il PO3 al 5' di ogni filamento. Indi digerisci il tuo DNA con i frammenti di restrizione. Fai correre il digerito e un non digerito di controllo (anch'esso trattato con fosfato radioattivo)in elettroforesi (in questi casi credo si usi cmq la PAGE.poi fai un'autoradiografia, il digerito (se effettivamente e' stato digerito) mostrera' una ridotta radioattivita' perche' il fosfato radioattivo 5' e' 'contenuto' nel frammentino di pochi nucleotidi eliminato dalla digestione. Quindi la tua banda principale avra' molto meno radioattivita' (dico molto meno perche' nn mi aspetto una reazione efficiente al 100%).Non so se in una page questi nucleotidi vengono persi o te li ritrovi in fondo: in quest'ultimo caso, il picco di radioattivita' te lo trovi molto al di sotto del tuo digerito. Per fare le cose per benino, puoi fare in parallelo un ulteriore controllo (una ibridazione in situ, tipo southern) per mostrare che hai caricato livelli eguali di DNA sia nel digerito che nel controllo negativo. |
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