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clonaggio SAP ligazione

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Musetta_89
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21 Messaggi

Inserito il - 02 gennaio 2017 : 14:25:23

Ciao a tutti.
Anche se siamo ancora in clima natalizio sto gi� pensando agli esperimenti da fare al mio rientro in lab

Dunque, sto facendo dei clonaggi con degli ampliconi di dimensioni comprese fra 400 e 1000 bp in vettori pGL3 basic vector (Promega) ed ho utilizzato fino ad ora un protocollo che prevede:
- purificazione della PCR
- digestione enzimatica
- purificazione della digestione enzimatica
- ligazione o.n. a 16�C
Tuttavia ho avuto molti problemi con le trasformazioni (poche colonie, vettore che si � richiuso su se stesso senza incorporare il frammento..), per cui, per quanto non strettamente necessario, mi � stato suggerito di defosforilare il vettore prima della ligazione.
In laboratorio dispongo di un enzima SAP della ditta EuroClone che per� fa parte di un kit per il clean up della PCR (in coppia con la ExoI per intenderci). Secondo voi posso tentare di mettere a punto un protocollo con questo enzima?