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paolaberna
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 13 agosto 2008 : 12:09:55
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Ciao a tutti...
secondo voi è possibile amplificare un prodotto di PCR con gli stessi primer usati nella prima PCR. In poche parole faccio una PCR ed ottengo un amplificato (una sola banda quella attesa). Se io faccio poi una seconda PCR partendo da questo amplificato con gli stessi primer ho possibilità di amplificare nuovamente il frammento? in caso devo cambiare qualche condizione di PCR?
Grazie a tutti
Paola
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 13 agosto 2008 : 12:42:34
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| Ci potrebbero essere dei problemi perchè i primer ora si legheranno proprio sulle estremità del template, e il legame potrebbe essere meno stabile. Comunque potrebbe anche funzionare, mai provato. |
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Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 13 agosto 2008 : 12:56:32
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| Perché non provi con una nested pcr? prendi prima primers più esterni alla sequenza di tuo interesse e nella seconda pcr usi i primers specifici per la tua sequenza... |
 
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Ayla
Utente Junior
Città: Wageningen
573 Messaggi |
Inserito il - 13 agosto 2008 : 13:20:51
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| secondo me funziona, ricordo di averlo fatto una volta. In ogni caso prova, e all'inizio non cambiare le condizioni. |
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antonella85
Nuovo Arrivato
Città: Firenze
15 Messaggi |
Inserito il - 13 agosto 2008 : 14:36:41
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il risultato potrebbe non essere ottimale... generalmente si disegnano i primers in modo che essi si appaino distanti (circa una ventina di basi) a monte e a valle rispetto alla sequenza da amplificare... concordo con Schuldiner86, potresti provare con una nested...  |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 13 agosto 2008 : 15:29:31
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Si può fare, io lo fatto alcune volte perchè avevo esigenze particolari, per cui una nested non era adeguata.
Comunque ogni reazione di PCR è un caso a se, quindi come ti è già stato detto parti dalle stesse condizioni che hai utilizzato per il primo amplificato e poi nel caso modificale se ci dovessero essere dei problemi! L'unica cosa che ti consiglio di fare è di diluire l'amplificato precedente (come si fa anche per le nested), prova a fare diverse diluizioni.
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 13 agosto 2008 : 15:54:11
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anch io l ho fatto....perche' anche le mie erano esigenze particolari,ma se la banda ce l hai,perche'devi rifare la PCR sullo stesso amplificato? ..concordo con GFPina per quanto riguarda le diluizioni ,l anniling non dovrebbe variare
e poi ... MA VOI SIETE GIA' OPERATIVI?????? io sono al mare un giorno si e l altro pure .... |
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