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midichloria
Nuovo Arrivato
75 Messaggi |
 Inserito il - 09 ottobre 2013 : 12:04:49
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Ciao a tutti! Ho un problema che non mi so proprio spiegare....
Ho fatto una PCR inversa di un plasmide in modo da eliminare un gene che non volevo amplificando con primers esterni in modo da escluderlo. Ho costruito i primers in modo da poter poi richiudere il vettore con XhoI.
La PCR inversa è venuta molto bene e molto concentrata, ho estratto la banda da gel (per essere sicura di non portarmi dietro prodotti incompleti della PCR) e ho tagliato con XhoI. Fin qui tutto bene. Ma quando faccio la ligation ottengo 4 bande! Il mio plasmide richiuso è sulle 4000bp, ma ho ottenuto anche bande a 2000bp, 8000bp e 12000bp. Le bande da 8000 e 12000bp immagino provengano dalla richiusura di rispettivamente 2 o 3 plasmidi assieme. Ma perchè la banda a 2000bp? Può essere una forma di plasmide superavvolto?
Grazie mille :)
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GFPina
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8408 Messaggi |
Inserito il - 09 ottobre 2013 : 13:56:40
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Ma il plasmide che hai migrato è circolare? Non lo hai linearizzato prima di seminarlo su gel?
Altrimenti difficilmente vedi la banda all'altezza giusta, la banda maggiore è quella del superavvolto che migra più velocemente.
Questo è uno schema di come migrano le varie forme plasmidiche:
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midichloria
Nuovo Arrivato
75 Messaggi |
Inserito il - 09 ottobre 2013 : 15:13:08
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| Si il plasmide è circolare, era lineare quando ho fatto la PCR inversa, e dopo l'ho circolarizzato visto che le estremità dei primers erano state costruite col sito per con XhoI. Ho pensato alle varie forme dei plasmidi circolari che si osservano solitamente nei gel, ma mi sembra impossibile che le altezze siano perfettamente 4000, 8000 e 12000... mi viene da pensare che siano appunto 1, 2 o 3 plasmidi richiusi insieme... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 09 ottobre 2013 : 17:53:01
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| Beh sì, è probabile che siano 2-3-4 plasmidi legati assieme, ma se fai migrare il plasmide non linearizzato non è facile capire il "peso reale" delle bande. |
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