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simoFC
Nuovo Arrivato
Prov.: aq
Città: l'aquila
8 Messaggi |
 Inserito il - 12 ottobre 2007 : 12:38:28
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ciao,
ho bisogno di qualcuno che ne capisce qualcosa di caspasi 8!!!
vi spiego il mio problema:
studio la fibrosi cistica e mi occupo della resistenza all'apoptosi delle cell fc rispetto alle cell ctr.
ho trattato le mie cell parentali e i cloni, in cui ho overespresso IkBaM, super repressore di NFkB, con TNFa 2000U/ml per 1h,3h, 6h, e dai lisati proteici ho fatto western blot per caspasi 8.
Mi aspettavo di trovare una maggior attivazione della caspasi nelle cell in cui avevo inibito NFkB, visto il ruolo di protezione di questo fattore di trascrizione nella regolazione dell'apoptosi e un inibizione della proteina nelle cell di fibrosi cistica, che mostrano tivazione di NFkB e quindi una maggior resitenza alla morte indotta da TNFa.
Il mio risultato è esattamente l'opposto!!!!
qualcuno mi sa dare una spiegazione??
grazie!!!
simo
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Giuliano652
Moderatore
Prov.: Brescia
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2007 : 14:39:02
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Generalmente la "spinta" che sbilancia verso la pathway TRADD-FADD-procaspasi 8
anzichè verso la pathway di attivazione di NF-kappaB non è tanto l'espressione
di NF-kappa B, quanto la diversa espressione delle molecole adattatrici
che portano all'una rispetto che all'altra pathway. No? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Giuliano652
Moderatore
Prov.: Brescia
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simoFC
Nuovo Arrivato
Prov.: aq
Città: l'aquila
8 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2007 : 14:50:48
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ciao giuliano652,
grazie per la tua risposta.
Ho sbattuto la testa per un anno sui western per JNK foforilato, ma non sono mai riuscita a vedere una modulazione dei livelli di espressione della proteina.
Considera che le mie parentali mostrano una over espressione di A1/Bfl, TRAF1 e cIAP2, noti target antiapoptotici di NFkB. |
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Giuliano652
Moderatore
Prov.: Brescia
6941 Messaggi |
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simoFC
Nuovo Arrivato
Prov.: aq
Città: l'aquila
8 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2007 : 15:48:56
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Sì, ho fatto western blot per JNK anche sugli estratti proteici dei cloni cellulari in cui avevo inibito NFkB, in seguito a stimolazione con TNFa breve: 10', 20', 40', 80', 160, ma non ho visto nulla.
Non so più cosa pensare perchè tutto quello che osservo è:
over espressione sia nei basali che in seguito a trattamento con TNFa di: A1/Bfl, TRAF1, cIAP2, resistenza all' apoptosi, iperattivazione di NFkB.
nei cloni in cui NFkB è inibito non osservo nulla di tutto questo, ma l'apoptosi non è mediata dalle caspasi 3 e 8, che sono invece attive nelle parentali.
Ho valutato anche l'espressione di altri geni quali: Bcl2, BclXL, p53(a livello trascrizionale e proteico) TRAF2, cIAP1 e XIAP, ma non sembrano essere coinvolti in questo contesto cellulare.
Tu riesci a trarre una spiegazione logica?
Grazie ancora
simona |
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Giuliano652
Moderatore
Prov.: Brescia
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simoFC
Nuovo Arrivato
Prov.: aq
Città: l'aquila
8 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2007 : 20:45:30
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sono sicura che si tratti di apoptosi perchè ho valutato la morte mediante l'utilizzo del kit CELL DEATH ELISA PLUS della roche, che quantizza la frammentazione in oligonucleosomi.
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Giuliano652
Moderatore
Prov.: Brescia
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gadano
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: roma
22 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2007 : 10:34:35
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| Hai provato la stimolazione con LPS+ATP invece che con TNF? |
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Didattica
) potresti fare un western per JNK fosforilato, o per la 
