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cometina
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2 Messaggi

Inserito il - 19 maggio 2010 : 17:20:25

salve a tutti,
� da poco che ho a che fare con le pcr e sto facendo delle RT-PCR semiquantitative in cui amplifico sia il gene di mio interesse sia l'RNA 18 S per valutare l'espressione del mio gene rispetto a quest'ultimo. (� cmq una multiplex pcr)

mi trovo sempre a dover fare due mix perche studio due diversi geni.

una delle due pcr (sempre quella per lo stesso gene che chiamo "1") presenta il bianco quasi sempre sporco.

ho pensato fosse la stock dei primer ma diluisco ogni volta i primer e qualche volta il bianco � ok altre volte invece noo!!!

il bianco dell'altro gene (che chiamo gene "2") � sempre pulito...

non penso sia dovuto agli altri reagenti perche uso gli stessi reagenti quando faccio la mix per il gene 1 e per il gene 2...inoltre la faccio sempre nello stesso momento

uso sempre H2O ultra pura Carlo Erba , che aliquoto ogni volta in diverse eppendorfine..

devo sterilizzare i tubilli?

devo autoclavare l'acqua carlo erba?

uso punte con filtro e pipette dedicate solo alla pcr che non usa nessun altro...cos altro posso fare??

che pensate della mia storia ;)??? spero sia stata abbastanza chiara!!

grazie a tutti!

beppe.cib
Nuovo Arrivato

41 Messaggi

Inserito il - 22 maggio 2010 : 18:32:36

Come fai a vedere che il bianco � sempre sporco?

michy2
Nuovo Arrivato

44 Messaggi

Inserito il - 24 maggio 2010 : 12:41:58

con bianco sporco intendi dire che nel gel vedi un'amplificato?
prova a pulire bene le pipette e il piano di lavoro, evita di fare l'RT dove apri prodotti di amplificazione, cambia spessissimo i guanti e attenta quando pipetti a non cross contaminare. puoi fare il bianco per primo, chiudere la provetta e poi dispensare l'RNA nei vari campioni.
spero di esserti stata di aiuto.

cometina
Nuovo Arrivato

2 Messaggi

Inserito il - 25 maggio 2010 : 14:42:19

si con bianco sporco intendevo dire questo, certo.

grz per tutti i consigli...mettevo in pratica gia tutti tranne il fatto di evitare di fare la RT li dove apro poi i tubilli con il cDNA..

grazie cmq per tutto il resto!

Gabriele
Utente

Prov.: Pisa
Citt�: Pisa

615 Messaggi

Inserito il - 25 maggio 2010 : 19:38:28

Pulisci qualunque cosa con NaOH 0,1 N

"Chi rinuncia alla libert� per la sicurezza, non merita n� la libert� n� la sicurezza. E finir� col perdere entrambe."

michy2
Nuovo Arrivato

44 Messaggi

Inserito il - 26 maggio 2010 : 10:37:37

[quote]Messaggio inserito da cometinagrz per tutti i consigli...mettevo in pratica gia tutti tranne il fatto di evitare di fare la RT li dove apro poi i tubilli con il cDNA..

� una regola fondamentale

si devono fare le reazioni di preamplificazione in luoghi separati rispetto a quelli dove si fa la post- amplificazione e la rivelazione