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milly85
Nuovo Arrivato
Prov.: Salerno
Città: salerno
5 Messaggi |
 Inserito il - 29 gennaio 2008 : 15:55:11
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ciao,
volevo sapere:in laboratorio per evitare contaminazioni delle reazioni PCR basta solo le irradiazioni UV oppure anche il ricircolo dell'aria?
Grazie,aspetto una vostra risposta
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 29 gennaio 2008 : 16:09:11
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| Parliamo di PCR su DNA o RNA?Perchè quelle su DNA le faccio quotidianamente senza ne l'UV ne il ricircolo dell'aria. Quelle su RNA richiedono decisamente più attenzione. |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 29 gennaio 2008 : 16:44:51
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ma le radiazioni UV su cosa?
le pipette possono essere contaminate all'interno con DNA genomico e le radiazioni non gli fanno niente e poi il circolo d'aria per cosa? |
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Cangrande
Utente Junior
Prov.: Verona
280 Messaggi |
Inserito il - 29 gennaio 2008 : 16:58:59
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| Per le contaminazioni di RNA non penso servano grandi accorgimenti. Se non stai attento/a ti si degrada quello che hai nella ep. |
Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala. |
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 29 gennaio 2008 : 18:37:25
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Se fai pcr di RNA devi stare attento a nn contaminare con DNA,infatti di solito si lavora sotto cappa,dove hai la circolazione d'aria forzata in modo da non contaminare con saliva,sudore,qualunque cosa.
L'UV al massimo inibisce la crescita batterica,di sicuro non decontamina. |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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ilarip
Utente Junior
Prov.: Bologna
Città: Bologna
432 Messaggi |
Inserito il - 29 gennaio 2008 : 19:18:28
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ciao a tutti oggi ho fatto la mia prima pcr
vi volevo chiedere 2 cose....
il PRIMER REVERSE che cos'è???cioè vediamo se ho capito bene se io ho un primer F tcgtc il mio primer R sarà gacatt 
i DNTP sono deossinucleotidi nn dideossinucleotidi giusto????
ringrazio anticipatamente chi potrà rispondermi
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Ho imparato.. .che le opportunità non vanno mai perse.
Quelle che lasci andare tu...le prende qualcun altro
Ho imparato...che è meglio dare consigli solo in due circostanze...
Quando sono richiesti e quando ne dipende la vita.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 29 gennaio 2008 : 20:28:59
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Citazione:
Messaggio inserito da ilarip
ciao a tutti oggi ho fatto la mia prima pcr
vi volevo chiedere 2 cose....
il PRIMER REVERSE che cos'è???cioè vediamo se ho capito bene se io ho un primer F tcgtc il mio primer R sarà gacatt
i DNTP sono deossinucleotidi nn dideossinucleotidi giusto????
ringrazio anticipatamente chi potrà rispondermi
Forse era meglio aprire un'altra discussione...
comunque non ho capito da dove vengono fuori i primers che hai scritto... senza una sequenza è impossibile dirlo!
Poniamo che la tua sequenza sia questa:
5'-AGTTAAGGTCTGATACGTAATGC-3'
scrivendola anche con la sequenza complementare è:
5'-AGTTAAGGTCTGATACGTAATGC-3'
3'-TCAATTCCAGACTATGCATTACG-5'
Il primer F si attacca alla sequenza 3'-5' e quindi sarà uguale ad un pezzo della seq. 5'-3', il contrario per il primer R.
Quindi corrisponderanno alla parte in grassetto:
5'-AGTTAAGGTCTGATACGTAATGC-3'
3'-TCAATTCCAGACTATGCATTACG-5'
quando si attaccano hai una situazione di questo genere:
5'-AGTTAAGGTCTGATACGTAATGC-3'
Primer R TTACG
AGTTA Primer F
3'-TCAATTCCAGACTATGCATTACG-5'
Ovviamente questa è una semplificazione perché i primer sono più lunghi (attorno a 20bp), la sequenza è più lunga e non è detto che il pezzo che amplifichi vada dall'inizio alla fine... ma queste cose dovresti già saperle!
I dNTPs sono deossinucleotiditrifosfato: dNTP (Wikipedia)
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ilarip
Utente Junior
Prov.: Bologna
Città: Bologna
432 Messaggi |
Inserito il - 29 gennaio 2008 : 20:53:04
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grazi emille Gp pina
scusa se nn ne ho aperto un altra di discussione...ne ho approffittato perchè era inerente sempre alla pcr |
Ho imparato.. .che le opportunità non vanno mai perse.
Quelle che lasci andare tu...le prende qualcun altro
Ho imparato...che è meglio dare consigli solo in due circostanze...
Quando sono richiesti e quando ne dipende la vita.
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milly85
Nuovo Arrivato
Prov.: Salerno
Città: salerno
5 Messaggi |
Inserito il - 30 gennaio 2008 : 22:14:11
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parlavo di PCR su DNA..ma dato che ci sei,mi spieghi che differenza c'è con quella di RNA?
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2008 : 10:12:50
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Scusate, ma c'è un po' di confusione.
Fare PCR da RNA è lo stesso che fare PCR da DNA, visto che l'RNA viene trasformato in cDNA ( per quanto riguarda le regole di contaminazioni).
Onde per cui la quale.....le accortezze da osservare sono le seguenti ( quelle che mi vengono in mente,se poi qualcuno ne conose altre le aggiunga pure):
Dove possibile usare un bancone separato per DNA ed uno per RNA ( per evitare cross contaminazioni tra le due fonti).
Pulire il bancone preferibilmente con varechina (il distruttore!),o sostanze che siano in grado di eliminare sia le contaminazioni dovute a DNA o RNA, ma anche RNAsi o DNAsi. L'unica cosa che elimina gli amplificati oltre alla varechina è il tempo.
Gli amplificati devono essere manipolati in un'altra stanza dove possibile, in caso contrario è ASSOLUTAMENTE INDISPENSABILE usare un bancone diverso da dove viene fatta la pre PCR.
Gli UV sono in grado di rompere piccole sequenze, noi solitamente vi mettiamo le pipette ed i rak dopo averli usati per le PCR, solo per precauzione.
LAVORARE SOTTO CAPPA è UN MITO DA SFATARE!Io ho usato anche questo metodo quando per mesi avevo le acque positive, ma non è servito a nulla, la contaminazione si ripeteva perchè la persona che usava i miei amplificati per fare sequenze non si cambiava i guanti ed apriva lo stesso frigo dove io avevo i primers da PCR.
E' corretto cercare di non sputacchiare, grattarsi e quant'altro mentre fai una PCR, ma, ricordo a tutti che la fonte principale di contaminazione sono i GUANTI, nel momento in cui toccano i tappini delle provettine contenenti DNA, RNA o amplificati.Per cui riflettete su cosa state facendo e vedete voi quando è il momento di cambiarseli.
Per il riciclo dell'aria penso che sia sempre bene aprire al mattino le finestre, ma solo per una questione "umana" e di igene ambientale, se poi hai le finestre su uno stradone trafficato come il nostro sinceramente è preferibile tenerle chiuse.
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PCR: evitare 
Didattica
