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Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
 Inserito il - 28 ottobre 2013 : 20:41:16
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Salve a tutti,
ho una curiosità da porvi. Come senz'altro già sapete, il contributo di Okazaki&collaboratori è stato cruciale per svelare l'arcano dell'andamento discontinuo della replicazione del DNA.
Tuttavia, non è stato lui a porre l'accento sul carattere SEMI-discontinuo del suddetto processo!
Son stati infatti necessari altri anni di ricerche, altri esperimenti - in particolare uno, condotto sul Polioma Virus, che hanno sciolto ogni dubbio al proposito.
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Ecco, io vorrei trovare un articolo che tratti questo argomento in maniera relativamente dettagliata.
Ho provato a cercare su internet ma non ho trovato nulla di chiaro né di completo.
In breve, si tratta di un esperimento in cui si fanno crescere questi virus su un terreno contenente azoto pesante (azoto 15, per intenderci).
L'esperimento prevede una corsa elettroforetica, la separazione dei filamenti e l'ibridazione di questi con frammenti. Sarà l'ibridazione a decretare la prova della semidiscontinuità.
Purtroppo non dispongo del protocollo completo e quindi ho capito la procedura solo per metà.
Se qualcuno di voi avesse una qualche idea circa l'argomento - o sapesse dove reperire un articolo (anche in inglese!) al riguardo, ne sarei molto felice! :)
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Un saluto a tutti e grazie dell'attenzione!
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
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Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
Inserito il - 29 ottobre 2013 : 14:20:20
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RM: ti ringrazio molto per il tuo contributo ma.. Questi che mi hai fornito son esperimenti circa la semi-conservatività, condotti da Meselson-Stahl.
..Mentre io ho bisogno di una speiegazione inerente alla semi-discontinuità! :)
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Vi ricordo che la discontinuità in generale è stata testimoniata dalla serie di esperimenti di Okazaki. Di cui già dispongo di sufficiente materiale.
Quello che mi manca è un articolo circa l'esperimento che ha provato la SEMIdiscontinuità (non la discontinuità!) condotto con il virus del polioma. :)
Rinnovo la mia richiesta d'aiuto e vi ringrazio nuovamente per l'attenzione! |
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Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2013 : 20:12:16
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Ho come l'impressione che il titolo di questa discussione abbia suscitato un tremendo scalpore, a giudicare dal numero di visualizzazioni xD ma che nessuno abbia poi sentito la necessità di esprimersi.
La buona notizia è che ho risolto il dubbio :) Siccome mi son sempre trovato così bene, qui, mi fa piacere condividerlo con voi.
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L'esperimento prevede l'utilizzo di DNA di virus del polioma, un virus a DNA circolare, simile ad un plasmide. Comodo lavorarci, perché non ha un'estensione eccessiva in termini di bp.
I virus son fatti crescere su un terreno in presenza di un isotopo pesante del carbonio in modo tale che ciascuna molecola di DNA sia formata da uno strand leggero ed uno strand complementare pesante.
Si estrae il DNA e lo si sottopone a tagli con enzimi di restrizione. Dopodiché, la mistura contenente il DNA spezzettato viene caricata su un gel d'agarosio, per effettuare un' elettroforesi tipica.
Alcuni dei frammenti risulteranno più lunghi degli altri - cioè, avranno un maggior peso molecolare. Ricordate infatti che in queste condizioni, stiamo separando i frammenti in base al peso molecolare! E quindi, andrò a prelevare questi frammenti più grossi - diciamo, per comodità, che preleviamo due frazioni di DNA, le due frazioni "più lente".
Questo DNA lo carichiamo su UN ALTRO gel - ma questa volta, in condizioni denaturanti. Quindi, caricheremo su una corsia del gel il DNA relativo al primo frammento - e sull'altra corsia, il DNA relativo al secondo frammento. Le condizioni denaturanti assicureranno una separazione degli strands complementari - con quelli marcati con l'isotopo pesante un po' più "lenti" nella migrazione elettroforetica.
A questo punto, subentra la terza fase: bisogna procurarsi i frammenti di okazaki specifici della replicazione del genoma di questo virus ed utilizzarli come sonde. Per farlo, è sufficiente indurre (a parte, ovviamente!) la replicazione del virus in presenza di dNTP marcati. I filamenti di neosintesi saranno inevitabilmente marcati e quindi fungeranno da "probes"..
Si può quindi provare ad effettuare l'ibridazione dei frammenti di Okazaki marcati con.. il DNA separato e denaturato, sottoposto ad elettroforesi prima.
Ebbene, si vedrà che i frammenti di Okazaki ibrideranno SOLO con uno dei due filamenti (ex. quello leggero) del primo sample - e SOLO con uno dei due filamenti (l'altro, quindi quello pesante) del secondo sample.
Questo è in accordo con la semidiscontinuità.
E soprattutto con il fatto che, nella bolla di replicazione, ci sia questa situazione qui:
..e cioè, che rispetto all'origine di replicazione (che sarebbe il "centro" della bolla) la replicazione procede in maniera discontinua da un lato e continua dall'altro lato dello stesso filamento.
In altre parole, si parla di semi-discontinuità in un contesto di bidirezionalità.
E tutto quadra.
:) Spero possa tornare utile a qualcuno di voi!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 02 novembre 2013 : 09:44:50
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| eheh, in effetti avevo notato il tuo msg e volevo cercare i papers originali, ma non ho ancora avuto tempo... |
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Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
Inserito il - 02 novembre 2013 : 12:13:28
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:D Grazie della partecipazione!
Il dubbio è risolto, ma.. se dovessi avere del tempo libero e trovare qualche articolo originale al riguardo (perché davvero, non riesco a trovare proprio nulla né su libri né altrove!) mi fa piacere.
Un saluto  |
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