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moni89
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 Inserito il - 16 febbraio 2012 : 16:40:10
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C'č qualcuno che gentilmente puō spiegarmi il meccanismo di denaturazione del DNA da parte dell'NaOH?? Ho cercato ovunque ma si parla solo di "destabilizzazione dell'elica".. vorrei capire in che modo, come interagisce con la doppia elica..
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0barra1
Utente Senior
Cittā: Paris, VIIčme arrondissement
3847 Messaggi |
 Inserito il - 16 febbraio 2012 : 16:51:30
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| Innanzitutto NaOH in soluzione non interagirā mai con il DNA, in quanto lo troverai in forma totalmente DISSOCIATA (Na+ e OH-). L'idrossido aumenta il pH e le basi vanno incontro a deprotonazione, si perde cosi' lo schema di legami idrogeno che tiene unito il doppio filamento ed il DNA denatura. Nota che non č un meccanismo specifico, si tratta semplicemente di una denaturazione detta alcalina, in quanto basata sull'incremento di pH. |
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moni89
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60 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2012 : 17:13:59
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| Mentre se aggiungo successivamente acido acetico in eccesso il DNA si neutralizza e si rinatura? |
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0barra1
Utente Senior
Cittā: Paris, VIIčme arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2012 : 17:28:43
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Neutralizzare una base forte con un acido debole non mi pare proprio un'idea fattibile, useresti quantitā bibliche di acido acetico ad occhio e croce.
Ricorrendo ad un acido forte (es. HCl) direi di si, ma non ho mai provato ne letto cio' da nessuna parte.
L'idea comunque č che la denaturazione č reversibile una volta eliminato l'agente perturbante (es. alzo la temperatura ---> DNA si denatura ---> diminuisco la temperatura ---> DNA si rinatura) |
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moni89
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Inserito il - 16 febbraio 2012 : 17:40:10
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| Ho parlato di acido acetico perchč nel protocollo che abbiamo usato noi andavamo a neutralizzare l'NaOH con acido acetico e acetato di potassio, con l'acido acetico in eccesso rispetto alla base, e permetteva la rinaturazione del DNA, in particolare quello plasmidico... |
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0barra1
Utente Senior
Cittā: Paris, VIIčme arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2012 : 17:43:38
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Citazione:
Messaggio inserito da moni89
Ho parlato di acido acetico perchč nel protocollo che abbiamo usato noi andavamo a neutralizzare l'NaOH con acido acetico e acetato di potassio, con l'acido acetico in eccesso rispetto alla base, e permetteva la rinaturazione del DNA, in particolare quello plasmidico...
Occhei, per curiositā che volumi e concentrazioni avete utilizzato di NaOH, acido acetico e acetato di potassio? |
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moni89
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Inserito il - 16 febbraio 2012 : 17:59:43
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| In realtā NaOH era presente in un buffer di 150 microlitri contenente anche SDS, mentre acido acetico e acetato di potassio si trovavano in un secondo buffer sempre di 150 microlitri. Il prof ci ha parlato di eccesso di acido acetico ma le concentrazioni non le so.. |
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Geeko
Utente
Cittā: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2012 : 18:35:52
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Quello che hai fatto era una mini-preparazione di DNA plasmidico e le concentrazioni che ho io sul protocollo sono queste:
-NaOH 0.2 N
-CH3COOH 5 M
-CH3COOK 5 M
Quindi fondamentalmente la seconda soluzione menzionata (che in realtā č la terza nel protocollo) contiene un tampone acido acetico/acetato. |
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moni89
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60 Messaggi |
Inserito il - 19 febbraio 2012 : 18:03:54
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| E il tampone acido acetico/acetato serve per rinaturare il DNA giusto? Fa precipitare l'SDS e le proteine e fa rinaturare e neutralizzare il DNA.. solo che il DNA plasmidico č pių piccolo e si rinatura facilmente mentre quello del cromosoma batterico forma un reticolo insolubile che precipita. Giusto? |
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