problemi di digestione GST-YFP

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darknihal
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3 Messaggi

Inserito il - 16 ottobre 2014 : 14:04:28

Ciao a tutti. Premetto che sono una tesista quindi mi scuso in anticipo se non riuscir� a spiegarmi al meglio. Sto lavorando con una YFP ricombinante nella quale ho agiunto 8 arginine a monte della proteina (il mio scopo � farla entrare nelle cellule e dalla letteratura ho visto che questo tag funziona). la struttura finale della proteina nel lisato batterico � GST-R8-YFP. Ho purificato la proteina con una resina di GSH agaroso usando un equilibrio a pH 8 ed eluendola a pH 8.5 (non posso scendere di pH perch� la proteina precipita, PI=7.25, inoltre a 7.5 si attacca cos� forte che non riesco a staccarla). la proteina riesco a purificarla in questo modo, ma ho problemi con la digestione. l'enzima che dovrebbe separare GST da r8-YFP � la prescission, la quale ha un range di pH di azione tra 7 e 8 e ho necessit� che questa digestione avvenga senn� con il GST la proteina non entra nella cellula (credo perch� sia troppo grossa). ora.. ho provato la digestione su colonna a pH 7 e precipita sulla resina, ho provato a pH p� alto e rimane comunque in resina. ho provato a far avvenire la digestione in soluzione invece che su resina a pH 7.6 e 7.8 e non va, non digerisce nulla.. per caso qualcuno di voi ha qualche altra idea?

darknihal
Nuovo Arrivato

3 Messaggi

Inserito il - 16 ottobre 2014 : 17:45:46

dimenticavo.. il tampone nella quale agisce la prescission �
50 mM tris (pH variabile, ne ho provati un po')
0,15 M NaCl
1 mM EDTA
1 mM DTT