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BeatriceT
Nuovo Arrivato
Città: Roma
11 Messaggi |
 Inserito il - 20 giugno 2011 : 17:01:56
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Salve scienziati, ho una domanda: come può essere di aiuto la pcr nell'individuazione di microdelezioni cromosomiche? se la pcr serve a clonare uno stesso frammento di dna, in teoria (per quello che ho capito io) devo andare a clonare quel pezzo in cui presumibilmente ho la delezione... e... dopo? Southern blot?
Ps: e come posso sempre tramite pcr diagnosticare malattie come la corea di hungtington o altre, basate sull'espansione di triplette?
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2011 : 18:15:18
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Puoi andare ad amplificare le regioni che sospetti delete scegliendo due primer che si appaino ai lati della microdelezione. Conduci una PCR e a questo punto carichi su gel, corri un'elettroforesi, metti sotto transilluminatore e osservi il risultato. Se non osservi nessuna banda, significa, trascurando errori sperimentali vari, che il tuo target è assente e dunque deleto.
Se tu usassi una Real Time-PCR potresti addirittura evitare le operazioni post-PCR andando a visualizzare in tempo reale l'amplificazione.
Per l'espansione di triplette immagino si tratti del medesimo procedimento, tuttavia osserverai in gel sotto UV bande con una mobilità minore (maggiore lunghezza) rispetto ad un controllo negativo (ossia soggetto sano con un numero di ripetizioni non patologico). |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2011 : 18:23:49
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Aggiunta: e se ti interessa individuare la presenza di delezioni più grandi, che potrebbero superare la lunghezza dei frammenti polimerizzati dalle Polimerasi, puoi effettuare una PCR-multiplex. Ossia in un'unica provetta mischi più primer, specifici per sequenze fiancheggianti regioni diverse, ma contigue, del genoma. In questo modo puoi determinare anche l'estensione della delezione e la presenza di più amplificati ti funge anche in un certo qual modo da controllo interno. Nel senso che se soltanto uno dei target non viene amplificato, è possibile che per quello la reazione non sia andata a buon fine (cattiva scelta dei primer?). Se invece mancheranno in elettroforesi anche altre bande, relative a regioni tutte contigue , questo è un buon indizio che effettivamente hai a che fare con una delezione.
NOTA: nel caso dovrai scegliere i primer in modo tale che:
i) abbiano temperatura di melting molto simile;
ii) fiancheggino regioni bersagio di diversa lunghzza, altrimenti non potresti distinguere tra loro i vari amplificati.
Un buon esempio dell'utiizzo della PCR-multiplex è la diagnosi della Distrofia musclare di Duchenne, dove è ormi prassi credo.
EDIT: se hai voglia di approfondire, ecco un bel paper: http://genome.cshlp.org/content/3/4/S65.full.pdf |
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