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PhBiotech
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 24 giugno 2015 : 07:46:20
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Ciao a tutti,
dovrei mettere a punto un ELISA per cui non è attualmente disponibile in commercio un KIT.
Nel mio caso specifico, dovrò detectare alcuni anticorpi presenti nel plasma umano. Quindi avrò una proteina ricombinante umana "coattata" sul mio pozzetto, a cui aggiungerò il plasma, e a sua volta un secondario coniugato HRP. La mia domanda riguarda gli standard..ovvero la necessità di potere anche determinare la concentrazione degli anticorpi di mio interesse. L'ideale sarebbe trovare in commercio un anticorpo che riconosca la mia proteina e utilizzarlo per fare una curva di concentrazione. Tuttavia, incorro nel problema della specie.. ovvero:
Son riuscita a trovre un anticorpo che reagisca con il mio human-antigene, ma chiaramente è fatto in specie come coniglio o topo, per cui dovrei utilizzare un secondario che vada bene per quelle specie..il che lo rende inadatto però all'utilizzo con i miei campioni da testare (di origine umana). Come posso ovviare a questo problema?
grazie mille per ogni eventuale dritta!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 24 giugno 2015 : 09:14:31
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Citazione:
il che lo rende inadatto però all'utilizzo con i miei campioni da testare (di origine umana).
Perché scusa? Se hai un anti-xxx fatto in coniglio prendi un secondario anti-IgG di coniglio e sei a posto. |
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PhBiotech
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 24 giugno 2015 : 10:08:07
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Beh..perché si possa dire un buon controllo dovrei usare lo stesso secondario..sia per gli standard che per i miei campioni...ma dato che le specie son diverse, non posso. La soluzione potrebbe essere ditrovare un anticorpo umanizzato come controllo.. se esistesse.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 24 giugno 2015 : 14:27:47
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Il dosaggio degli autoanticorpi umani in genere non viene fatto con una curva standard, ma utilizzando un campione ad alto dosaggio al quale si da il massimo di una certa unità arbitraria, es. 10000 AU e i campioni in esame si fanno come rapporto rispetto a questo.
Alternativamente si può costruire una sorta di curva standard utilizzando diverse diluizioni di questo campione fortemente positivo.
Puoi però anche fare come pensavi tu e fare la curva standard con un anticorpo contro la proteina umana prodotto in un altra specie. Ma la messa a punto non è facilissima.
Io ho messo a punto un test di questo tipo utilizzando un anticorpo di topo come standard.
Devi tener conto che la tua quantificazione sarà comunque sempre relativa, non puoi dare un valore di quantificazione (tipo ng/ml), ma avrai sempre delle unità arbitrarie che decidi tu.
La reattività degli anticorpi (umani e dell'altra specie) nei confronti della tua proteina sarà sicuramente diversa e lo stesso anche per gli anticorpi secondari.
Quello che puoi fare è testare diverse concentrazioni di anticorpo che utilizzi per fare la curva standard in modo da trovare la situazione in cui hai OD paragonabili a quelle dei tuoi campioni (così i campioni ti ricadono all'interno della curva).
E per quanto riguarda i secondari, che necessariamente saranno diversi, usarne la stessa "quantità".
Ad es. io ho un anti-mouse concentrato 0.5mg/ml e un anti-human concentrato 1mg/ml, quindi uso il primo 1:5000 e il secondo 1:10.000 e la quantità finale di anticorpo nelle due diluizioni è la stessa.
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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PhBiotech
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 24 giugno 2015 : 15:07:20
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 Scritto da MolecularLab Mobile
Eh era quello che pensavo di fare..rapportare ad altri sieri umani..sebbene la quantificazione a quel punto sara del tutto relativa! Grazie mille GFPina |
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