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orange87
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 13 ottobre 2012 : 20:20:59
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Ciao a tutti! ho bisogno di un aiuto per capire come fare una digestione con due enzimi di restrizione differenti! devo digerire un vettore e un inserto con SnaBI(blunt) e NotI(sticky). I due siti nel vettore sono molto molto vicini (circa 20 bp). Il sito della NEB mi consiglia di usare buffer2 per la doppia digestione. Ma con questo buffer l'attività enzimatica di entrambi è il 50% dell'attività ottimale!come posso procedere? devo fare una digestione sequenziale o metto entrambi gli enzimi insieme?e come devo procedere per quanto riguarda il tempo di incubazione e altri parametri vari nei due casi? Chiedo scusa per le banalità ma sono a inizio tirocinio e non ho molta dimestichezza con certe cose! grazie in anticipo per l'aiuto 
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 13 ottobre 2012 : 22:56:19
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| potresti sia fare una digestione e poi l'altra, sequenzialmente, sia fare le due digestioni insieme. 50% di attività per entrambi mi sembra ancora accettabile quindi io personalmente digerirei direttamente con gli enzimi insieme in buffer2. Magari prolunga il tempo di incubazione così sei sicuro che tagli tutto il DNA.Il tempo dipende anche da quanto DNA hai. Io generalmente digerisco tre ore, tre ore e mezza (5-8 microgrammi DNA, con eccesso di enzima circa 5:1). Potresti provare così. Magari prima di andare oltre ti fai un bel gel e controlli che la digestione sia completa. |
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orange87
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2012 : 00:53:21
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Grazie mille!! domani proverò in questo modo!!  |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 16 ottobre 2012 : 23:37:35
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Ho due domande. La prima è per orange: non hai la versione High Fidelity di NotI? Se sì, puoi fare la doppia digestione in buffer 4.
Seconda domanda, per Spemann: quando digerisci così tanto DNA in una sola reazione, qual è la tua efficienza? Io di solito faccio più tubi, digerendo 1.5-2 ug in ciascuno, e poi metto tutto insieme. ma se a te riesce con una buona resa forse potrei provare. che dici? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2012 : 00:15:11
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La resa e' vicina al 100%: su gel vedo DNA linearizzato, unica banda, quando faccio clonaggio le colonie del controllo negativo sono in genere molto poche.
All'inizio facevo dei controlli separati con i due enzimi da soli, nel buffer comune, per assicurarmi della efficienza di ogni enzima. Ora che ho ottimizzato tempi e quantita' di enzima nn faccio piu tale controllo. Io direi che l'eccesso di enzima (generalmente 40 unita' per 8 microgrammi, a volte anche di piu') e il tempo (3-4 ore)dovrebbero assicurarti una resa molto molto alta (non dico 100% ma quasi).
In passato ho digerito anche quantita' piu' alte di DNA, 14 microgrammi per la precisione: aumentavo il volume di digestione (se non ricordo male 100 ul o poco piu') e digerivo overnight. |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2012 : 12:39:24
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| grazie mille. provero' a fare cosi' allora! |
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Discussione |
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digestione con due 
Didattica
