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teclab
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
 Inserito il - 23 settembre 2009 : 16:58:56
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salve a tutti,
mi trovo nella situazione di dover discriminare in una cucciolata di topi il gruppo di topi WT, quelli knock-out per un determinato gene e quelli eterozigoti.
Ho trovato molti riferimenti relativi all'uso di 3 primers, 2 fw ed 1 reverse, tuttavia non ho trovato una spiegazione abbastanza esauriente di questa tecnica. Se ho ben capito, il primo fw è presente sia nel wt che nel KO perchè si trova prima della zona di gene escissa; il secondo è presente solo nel wt perchè si trova all'interno del gene escisso; il reverse è identico per entrambi.
quindi otterrò per il KO un amplificato della zona compresa tra il primo fw ed il reverse, per il wt un amplificato di dimensione diversa ottenuto dalla zona compresa tra il secondo primer ed il reverse e per l'eterozigote entrambi.
Quello che non capisco è perchè nel wt viene amplificato solo il dna compreso tra il secondo fw ed il rev?
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2009 : 17:16:41
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| Dipende da dove sono messi esattamente i primers, comunque è molto probabile che il tratto fra il primo fw e il rev sia troppo lungo e quindi non venga amplificato. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2009 : 17:59:12
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Si è esattamente come dice chick!
Io lo faccio e funziona esattamente in questo modo, nel KO ho una delezione di circa 12kb, quindi ho:
- un primer F1 prima della delezione
- un primer F2 all'interno della zona che deleta
- un primer R dopo la delezione
quando faccio la PCR il primer F2 ovviamente funzionerà solo sul WT.
Il primer F1 si lega sia al DNA WT che a quello del KO, però la differenza è che nel KO ha da amplificare un frammento di circa 400bp e non ci sono problemi, nel WT dovrebbe amplificarmi un frammento da 12400bp ma le condizioni di PCR non lo permettono quindi non si amplifica nessuna banda.
In genere il funzionamento è quello!
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