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Fanny
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 15 febbraio 2007 : 12:39:21
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Ciao a tutti!
Sono una neoiscritta. Ho un grosso problema con una genotipizzazione di topi transgenici e vi chiedo un aiuto! Allora, nella prima genotipizzazione che ho fatto, 2 topi su 4 mi sono venuti positivi per l'allele Wild Type, mentre per quello Knock Out non ancora riesco a trovare le condizioni giuste (benchè io segua il programma per PCR che mi hanno fornito dal laboratorio che mi ha inviato i topi). Quando sono andata a fare una seconda genotipizzazione su una nuova nidiata, nessun topo è risultato positivo per l'allele WT e ciò che è peggio è che non c'è stato amplificato nemmeno per il controllo positivo che ho usato (i due topi con la banda WT della prima genotipizzazione). Da allora ho provato di tutto: ripreparare l'acqua, modificare la quantità di magnesio, ma niente. Anzi, cosa ancora più strana, in una PCR in cui usavo la quantità doppia di MgCl2, ottenevo una debole banda nel controllo positivo, ma poi, ripetendo la reazione nelle stessissime condizioni su tutti i campioni, non ho ottenuto nessun amplificato, di nuovo nemmeno nei controlli positivi.
Ho anche ricontrollato il DNA ed è buono, non riesco proprio a capire dove possa essere il problema. 
Che si siano rovinati i primers? E' possible?
Grazie mille a tutti in anticipo!
Fanny
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
 Inserito il - 15 febbraio 2007 : 14:35:19
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Prima di tutto ti consiglio di non postare lo stesso topic su piu pagine, non è gradevole, anche perchè va a finire che non si sa mai a quale rispondere, pensa un po a chi controlla che il forum funzioni bene.
Per quel che riguarda poi i tuoi problemi di PCR per prima cosa proverei con una aliquota nuova di primers, e se ce l'hai anche di buffer e MgCl2.
Se la PCR continua non venire amplifica un frammento sicuro, come l'actina.
Per il controllo cosa usi, un estratto di DNA genomico oppure una precedente PCR?
Se è il secondo caso forse i problemi sono dati anche da questo.
Per ultima cosa, la macchina funziona?
prova a fare una diagnostica delle temperature.
Ciao e buona fortuna
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Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw |
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Fanny
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 15 febbraio 2007 : 20:59:39
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Ciao!
Scusa se ho fatto un po' di casini con il post...
Allora, purtroppo non ho un'altra aliquota di primers, ma molto probabilmente mi toccherà ordinarli di nuovo. Ho provato anche ad usare un kit di amplificazione che in laboratorio usano per il sequenziamento, ma niente da fare. Come controllo positivo riamplifico il DNA genomico del campione in cui era venuta la banda la prima volta. La macchina è ok, anche perchè ne ho usata più di una.
Boh!
Grazie comunque!
Fanny |
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Fanny
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2007 : 09:33:44
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Ciao!
Il problema è stato risolto! Mi sono fatta prestare una master mix e sono venute bande perfette per il WT e addirittura anche per l'allele KO, che non era mai uscito. Forse, allora, mi si è in qualche modo contaminato l'enzima.
Ciao ciao! |
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