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CRISTIAN
Nuovo Arrivato
92 Messaggi |
 Inserito il - 27 novembre 2007 : 10:25:12
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ciao a tutti avrei bisogno di un aiuto!! ho dei topi transgenici per un gene x, di questo gene inserito conosco bene la sequenza ma no dove si è inserito!! (Come è possibile sapere dove si è inserito?)
Il mio problema è che vorrei discriminare i topi transgenici eterozigoti per il transgene dai topi omozigoti per il transgene. Il gene inserito è un gene umano che i topi normalmente non hanno.
come posso fare?
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2007 : 13:22:49
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Se stai parlando di un transgene classico non puoi farlo con la classica tecnica dei tre primers
potresti fare una PCR semiquantitativa con 4 oligo, 2 per il tuo gene e 2 per un controllo es actina.
bassi cicli di amplificazione, tipo 20-25, e devi quantizzare il DNA genomico per fare la PCR sempre nelle stesse condizioni. Fai il controllo negativo, positivo eterozigote e positivo omozigote insieme ai campioni incogniti.
Carichi la PCR su gel ed in base al rapporto che hai tra l'actina ed il tuo gene X sai se è omozigote o eterozigote.
se hai la real time è molto più facile e banale, basta che valuti le distanze tra le curve di amplificazione dell'actina e il tuo gene X.
Un'altra strategia potrebbe essere fare 3 primers, uno che si annila su una regione che si trova sia nel topo WT che in una regione del costrutto che è stato fatto per ottenere il topo transgenico, poi un altro primer specifico per il transgene (es il cDNA) e l'altro specifico per il WT... sempre PCR semi-quantitativa, bassi cicli di amplificazione e valutazione del rapporto tra le bande.
non c'è altro modo se non sai il cDNA dove si è inserito.
Per sapere dove si è inserito è un lavoraccio abbastanza gravoso per affrontarlo così nel tempo libero.
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato
92 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2007 : 18:35:22
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oppure???????????
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2007 : 19:28:01
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Bhé le alternative sarebbero infinite, ma di certo non semplici come quelle che ti ho proposto,
es fare una RACE (rapid amplification of cDNA ends) (kit Invitrogen)
ovvero prendi un oligo ed amplifichi una regione del tuo gene X fino ed oltre al bordo 5' o 3'
cloni questa sequenza in un vettore e lo sequenzi
dal sequenziamento deduci un minimo di basi nucleotidiche per disegnare un primer o per identificare la regione genomica dove si trova il tuo gene X.
quindi fai le PCR con i classici 3 primers che ti disegni tu
altra possibilità
Fare una serie di Southern con una sonda sul tuo gene X tagliando il DNA genomico con diversi enzimi e calcolarti in base alle bande ottenute quali regioni genomiche hanno quei siti a quelle distanze, poi PCR per identificare tra le zone possibili qual è quella in cui c'è veramente il gene x.
e poi ti disegni i 3 primers classici
altre possibilità sono improponibili se non puoi fare neanche una PCR semiquantitativa.
Non aver paura. è più semplice di quanto tu possa immaginare, chiudi gli occhi e buttati sulla PCR semiquantitativa ;)
ti assicuro che sopravviverai
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato
92 Messaggi |
 Inserito il - 28 novembre 2007 : 08:37:14
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grazie mille!!!! |
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