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Discussione |
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scienza 82
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
 Inserito il - 04 aprile 2009 : 21:26:20
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Ciao a tutti
qualcuno sa dirmi come si fa una reazione di ligazone?....Praticamente
Grazie
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legolas
Utente
Prov.: Lecce
Città: Trepuzzi
723 Messaggi |
Inserito il - 05 aprile 2009 : 00:00:37
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| Vuoi descritta la reazione di ligazione o un protocollo di laboratorio? |
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scienza 82
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
Inserito il - 05 aprile 2009 : 10:46:05
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| Se hai un protocollo di laboratorio...grazie mille |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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scienza 82
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
Inserito il - 05 aprile 2009 : 23:05:53
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| Grazie mille, ho guardato e sono molto utili....magari se qualcuno di voi puo' darmene uno che già ha provato in laboratorio e funziona bene potete passarlo? Grazie |
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Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 06 aprile 2009 : 14:58:56
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Copio e incollo i miei vecchi appunti di lab quando facevo clonaggio:
LIGAZIONE
Per la ligazione occorrono:
- Vettore
- Inserto
- Buffer 10X
- Ligasi (T4 DNA Ligasi Fast (promega))
In condizioni normali occorre avere un rapporto molare 3:1 nei confronti dell’inserto (si può spingere molto la reazione aumentando ulteriormente il rapporto a favore dell’inserto, ma si corre il rischio che si creino dei multimeri di inserto o rilegati fra loro o all’interno del vettore).
Tale rapporto si trova calcolando il rapporto molare secondo la seguente regola:
ng di vettore . kb di inserto inserto
__________________________ . rapporto molare ______ = ng di inserto
kb di vettore vettore
(indicativamente i ng di vettore che si utilizzano sono 100)
Con la T4 Liga Fast occorrono 15 minuti a temperatura ambiente (anche 30 min)
Con la Ligasi T4 (senza buffer Fast) va usata O.N.
E’ buona norma fare i controlli durante la ligazione:
- provare a ligare il vettore defosforilato senza inserto(se è stato correttamente defosforilato non si può ligare) quindi non penetra nei batteri essendo linearizzato.
- utilizzare il vettore cippato, ma non la ligasi né l’inserto per eventualmente valutare se sono rimaste delle copie non digerite correttamente e che quindi trasformano i batteri ma non contengono l’inserto e quindi creano dei falsi positivi.
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suffi
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 15 luglio 2010 : 19:02:13
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Ma il rapporto molare vettore-inserto da cosa è dettato? perchè si usa 1:3? c'entra qualcosa il rapporto tra le paia di basi di lunghezza dei due?
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 15 luglio 2010 : 20:24:13
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la lunghezza c'entra eccome. La facilità con cui il vettore si richiude su se stesso dipende in un certo dalla sua lunghezza. Più è lungo meno frequentemente le sue estremità saranno abbastanza vicine da essere ligate dalla ligasi. Del resto il tuo interesse è che sia l'inserto a ligarsi all'interno del vettore, cioè che le sue estremità formino legami covalenti con le estremità del vettore. Questo dipende molto dalla concentrazione relativa di vettore e inserto. Sperimentalmente una concentrazione 3:1 inserto:vettore è un buon compromesso per i vari tipi di clonaggio. Ma non è sempre così. Per esempio i clonaggi a estremità piatte (blunt end) possono essere favoriti da una concentrazione + alta di inserto (alcuni lab usano per esempio 4:1 o addirittura 5:1). Ci sono tanti fattori che poi influiscono sulla riuscita di una ligazione: quantità di ligasi, tempo di incubazione, concentrazione di ATP ecc.
Riuscire a considerare tutti questi fattori e pianificare al meglio la strategia di clonaggio è senz'altro utile e necessario. Tuttavia, spesso occorrono varie prove empiriche prima di ottenere il risultato sperato.
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suffi
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 16 luglio 2010 : 20:14:15
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lo chiedevo perchè a me in laboratorio avevan detto che si DEVE usare un rapporto pari a quello tra il numero delle paia di basi di inserto e vettore per avere una quantità EQUIMOLARE e io ho avuto da ridire su questa affermazione, prendendomi poi un cazziatone per essere "presuntuosa" e non ascoltare le spiegazioni...
cercavo solo una risposta esauriente (forse solo una conferma di quello che penso io..) al perchè si usa un determinato rapporto molare e cosa si intende per rapporto molare... |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 16 luglio 2010 : 21:09:55
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vabbè sicuramente hanno esagerato a farti il cazziatone. Tu hai tutto il diritto di chiedere spiegazioni su una cosa che nn sai. In teoria per calcolarti il peso molecolare del tuo vettore o inserto dovresti sommare il p.m. di ogni A, di ogni G di ogni t e di ogni C, guardare quante moli hai di in una data quantità di vettore e poi calcolarti di conseguenza il numero di moli (e quindi di ng)di inserto che ti occorrono.
Nella pratica però per semplificare le cose assumi che i nucleotidi abbiano tutti un peso standard (anche perchè spesso vettori e/o inserti nn sono completamente sequenziati) e quindi in tal caso la differenza in molarità sarà data dalla lunghezza in paia di basi di ciascuna specie molecolare. Facciamo uno o due esempi: hai un vettore di 3000 bp e un inserto di 3000 bp. In tal caso per avere un rapporto molare 1:1 dovrai usare stesse quantià dell'uno o dell'altro (per esempio 30 ng di vettore e 30 ng di inserto).
Facciamo l'esempio invece di un inserto che sia la metà del vettore: 500 bp contro 1000 bp. Intuitivamente, se usi un rapporto equimolare di 1:1 vorrà dire che per 30 ng di vettore ne dovrai usare 15 di inserto. Infatti se applichi la formulina:
1 X 500/1000 X 30 ng = 15 ng che è la massa dell'inserto in ng che devi usare per avere un rapporto molare 1:1.
La formula a cui mi riferisco è:
lunghezza inserto in bp / lunghezza vettore in bp X massa vettore in ng X rapporto molare
(se il rapporto molare è 3:1 per l'inserto dovrai mettere 3 in fondo alla formula, se è 5:1 dovrai mettere 5 ecc). |
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