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Balba
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 31 agosto 2010 : 13:21:04
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Ciao a tutti,
ho un problema per quanto riguarda una ligazione che ho fatto tante volte ma che ora non ne vuol sentire di venire. Devo ligare un plasmide digerito con PmeI -XbaI con un frammento digerito con gli stessi enzimi. Dopo la trasformazione le piastre sono vuote (trasformo mediante elettroporazione).
Escludo un problema di cellule perchè trasformano bene i plasmidi richiusi. Ho provato tre ligasi diverse (Neb, Takara e Fermentas) a diverse temperature (16°C o 25°C), a diversi tempi (1h o O/N).
Prima della ligazione, dializzo con i filtrini millipore per eliminare i sali..
Ho provato a caricare le ligazioni su gel e ho visto tre bande:
il frammento, il plasmide linearizzato senza inserto e il plasmide linearizzato con il frammento. Non dovrei trovare un richiuso?
Vi ringrazio in anticipo per i vostri consigli.
Ciao ciao
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 02 settembre 2010 : 20:17:08
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| Forse il frammento è stato digerito solo da un enzima. E' un prodotto di pcr? |
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Balba
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 03 settembre 2010 : 13:16:25
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Dopo la digestione PmeI-XbaI estraggo da gel. E i frammenti hanno le dimensioni attese. Quindi escludo un problema di digestione. Stavo pensando ad un problema di contaminazione da nucleasi che magari mi modificano le estremità. Ora ho digerito il plasmide con entrambi gli enzimi separatamente e voglio provare a richiuderlo con la ligasi.
Qualche altra idea? |
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gilthanas
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2010 : 18:03:28
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quanto è grosso il tuo frammento di PCR??
Sopra i 1000-1500 diventa un pò più problematica la ligation....se è di piccole dimensioni hai un problema tecnico nella procedura, nel caso contrario leggi qua sotto...
è da tanti anni che faccio clonaggi e cose di questo tipo e spesso mi sono trovato in queste situazioni...quando si deve clonare un prodotto di PCR (come spesso accade) è sempre più difficile che legare 2 frammanti provenienti da 2 diversi plasmidi...
il modo migliore che conosco quando si hanno questi problemi è quello di
1. subclonare il tuo prodotto di PCR in un vettore batterico tipo pTOPO o pCR di vario tipo usando il TA-cloning o il TOPO-TA cloning (procedimento facilissimo e molto efficiente)
2. digerire plasmide accettore e plasmide pTOPO o quello che hai comntenente il tuo inserto
3. estrazione e purifiacazioni delle bande da gel (con colonnnine o con quello che hai a disposizione)
4. ligazione e trasformazione
quando ho avuto problemi questo procedimento li ha smepre risolti...c'è un passaggio in più ma alla fine ti fa risparmiare il tempo di molti insuccessi con la digestione diretta...
se credi prova, poi ci dici... |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2010 : 19:14:07
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Citazione:
Messaggio inserito da Balba
Dopo la digestione PmeI-XbaI estraggo da gel. E i frammenti hanno le dimensioni attese. Quindi escludo un problema di digestione. Stavo pensando ad un problema di contaminazione da nucleasi che magari mi modificano le estremità. Ora ho digerito il plasmide con entrambi gli enzimi separatamente e voglio provare a richiuderlo con la ligasi.
Qualche altra idea?
Se fosse un problema di contaminazione da nucleasi, non avresti ligazione in nessun caso. Il frammento che devi clonare è amplificato da pcr o altro?
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Balba
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 06 settembre 2010 : 11:10:21
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| Caro gilthanas, ti ringrazio per il consiglio ma è esattamente quello che abbiamo fatto. Usiamo il TA- Cloning e il TOPO-Cloning da anni. Purtroppo siamo fermi al punto n.4... |
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Balba
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 06 settembre 2010 : 11:38:12
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Caro SpemannOrganizer,
scusami rileggendo mi sono resa conto che non ho specificato che il mio frammento non è un prodotto di PCR. Viene da un pCR2.1 TOPO... |
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