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tapera
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11 Messaggi |
 Inserito il - 06 giugno 2012 : 12:29:11
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Help aiutatemi...
Decidete di caratterizzare un locus microsatellite tetranucleotidico.
Disegnate a vostro piacimento la sequenza da amplificare che contiene il microsatellite e determinare la lunghezza del prodotto di PCR che otterrete da un individuo eterozigote per 6 e 7 ripetizioni.
Grazieee
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
 Inserito il - 06 giugno 2012 : 12:57:18
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Prova a scrivere come lo risolveresti tu, da li' se ne puo' discutere assieme.
E' certamente più utile per te :)
PS: benvenuto/a |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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tapera
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2012 : 13:04:41
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Grazie :)
di solito i microsatelliti sono formati da ripetizioni -CA-
allora prendo il mio locus -CACA-
e fino a qui è banale... poi per fare la PCR faccio partire prima il primer in modo da caratterizzare il microsatellite, e poi? |
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tapera
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2012 : 13:10:59
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cioè :
________________CACA_________________
primer
----->
<-----
________________GTGT_________________
come faccio a determinarne la lunghezza?
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2012 : 13:55:04
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Ri-ciao 
Innanzitutto CACA è l'iterazione del dinucleotide CA, dunque nel tuo caso non è appropriato vista la consegna dell'esercizio che richiede invece un tetranucleotide, come esempio CACG.
Per permettere l'amplificazione, i primer devono essere disegnati di modo tale che si appaino con le sequenenze fiancheggianti il tuo microsatellite, non con il microsatellite stesso. La ripetizione della stessa sequenza, infatti, creerebbe problemi di specificità di target ai primer.
Per la caratterizzazione, si tratterà poi di effettuare un'elettroforesi con il tuo prodotto di PCR, di modo da separare il frammento con 6 ripetizioni CACG (che migrerà più rapidamente nel gel) da quello con 7 ripetizioni CACG, che data la lunghezza procederà più lentamente tra le maglie del gel.
Il risultato finale, percio', sarà un gel con due bande all'altezza di [7 ripetizioni x (4 base/ripetizione) + basi della sequenza fiancheggiante] e [6 ripetizioni x (4 base/ripetizione) + basi della sequenza fiancheggiante] |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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tapera
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2012 : 17:02:01
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| Grazie :) |
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tapera
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2012 : 19:02:03
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un ultima cosa dato che l'esercizio dice di un individuo eterozigote, secondo te, vuol dire che un allele deve essere di 6 e uno di 7 ripetizioni?
Il mio libro però usa negli esempi CACACA e non CAGT.. Boh
scusami ma ho molti dubbi su questo esercizio, sembra banale ma io non lo capisco proprio uffA! |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2012 : 19:29:05
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| a mio parere la teoria è giustissima, e se si tratta solo di un esercizio teorico mi trovo. ma vi potrebbe essere chiesto come pensate di distinguere su gel 2 frammenti che si differenziano solo per 4 nt |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2012 : 19:37:21
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| comunque sì, un eterozigote ha i due alleli identificanti il microsatellite diversi tra loro. nel tuo caso, dunque, avrà sia l'allele costituito da 6 ripetizioni sia quello costituito da 7. |
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tapera
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2012 : 19:43:56
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| per ottenere due bande ben distinte si possono fare più cicli di PCR. |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2012 : 19:58:55
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ah, ecco, mi sono trovata una referenza da sola :) http://products.invitrogen.com/ivgn/product/16550100
comunque non credo che aumentando il numero di cicli otterresti qualcosa: avresti solo più DNA alla fine della PCR, quindi bande più spesse e ancora meno distinguibili |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2012 : 21:39:49
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Citazione:
Messaggio inserito da roberta.s
a mio parere la teoria è giustissima, e se si tratta solo di un esercizio teorico mi trovo. ma vi potrebbe essere chiesto come pensate di distinguere su gel 2 frammenti che si differenziano solo per 4 nt
Basta utilizzare un gel di poliacrilammide al posto del gel di agarosio!  |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2012 : 10:26:30
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| grazie GFPina, c'^è sempre da imparare! |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2012 : 11:46:17
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Se ci rifletti un istante, sono sicuro che si tratta di una nozione che già possedevi:
la "lettura" dei risultati del sequenziamento di Sanger veniva infatti fatta su gel che potessero permettere la discriminazione di sequenze distinte, e distanti, in lunghezza per una sola base. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2012 : 13:16:47
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| Infatti, non so dove ho la testa. Bella figura :S |
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esercizio 
