misurare l'attivazione di un enzima

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ERK1/1 spingosine kinase estrogen estrogeno

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Discussione

PIM3
Nuovo Arrivato

19 Messaggi

Inserito il - 15 ottobre 2013 : 11:00:50

Ragazzi!

Sapreste mica come misurare l'attivazione della MAPK ERK1/2 grazie all'intervento della SK(sphingosine kinase)dopo induzione con estrogeno nelle cellule della linea tumorale al seno MCF-7?

Mi spiego meglio,

SITUAZIONE: quando le cellule MCF7 vengono indotte con E2 (estrogeno) la quantità cellulare di ERK1/2 fosforilato, e quindi attivo, aumenta.

IPOTESI: la sfingosine kinase (SK) è convolta in questo percorso metabolico.

METODOLOGIA: determino, utilizzando un western blot, la quantità di ERk1/2 phosforilato prima e dopo induzione con E2 in cellule stabilmente transfettate con : -empty vector - SK (e quindi overexpression di SK) -mutante negativo dominandte (SK G82D)che blocca l'attivita della SK

RISULTATI: vedo che la quantità di ERk1/2 fosforilato è maggiore nella cellule che overesprimo la sk e nulla nelle cellule che esprimono il mutante.

CONTROPROVA: ?????
quale altro esperimento posso utilizzare per verificare l'ipotesi???

AIUTATEMI SONO DISPERATAAAAAA

chick80
Moderatore

Città: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 15 ottobre 2013 : 16:47:56

Di già dovresti normalizzare rispetto a Erk1/2 totale (fosforilato e no).

L'altro esperimento da fare potrebbe essere un esperimento di rescue in cui transfetti (transientemente) le tue cellule SKG82D con SKwt e vedi il ripristino della fosforilazione.

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PIM3
Nuovo Arrivato

19 Messaggi

Inserito il - 15 ottobre 2013 : 16:59:44

Chick80,

Grazie mille per il suggerimento!

Sarah